Informasi

Apa yang dimaksud dengan pewarnaan Giemsa pada kromosom?

Apa yang dimaksud dengan pewarnaan Giemsa pada kromosom?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya mendapat pertanyaan dalam ujian saya dan menulis yang berikut dan saya tidak mengerti apa yang salah di dalamnya:

Pewarnaan Giemsa merupakan salah satu metode pewarnaan untuk pewarnaan khususnya malaria dan penyakit parasit lainnya. G-band terjadi karena pewarnaan Giemsa terdiri dari bahan kaya A,T yaitu gen yang buruk sehingga terjadi pita gelap dan putih. Setiap kromosom memiliki reaksi yang unik terhadap pewarnaan Giemsa sehingga terjadi G-band.

0 poin. Saya tidak mengerti apa yang salah dengan itu, karena dalam komentar mereka tentang pertanyaan yang sama di ujian pertama saya, mereka juga menulis pertanyaan tambahan: Apa itu G-band? Bagaimana mereka terbentuk dan mengapa? Kali ini saya menjawab hal-hal yang diberikan dan mendapat nilai nol.

Mungkin, kesalahannya adalah saya tidak menjawab pertanyaan dalam lingkup Biologi medis dalam beberapa hal. Namun, saya tidak yakin persis apa itu.

Bagaimana Anda menjawab pertanyaan ketika Anda tahu bahwa kursus itu tentang biologi medis?

Tolong, tambahkan tag Giemsa.


Giemsa bukanlah methid khusus untuk menodai malaria atau parasit lainnya. Itu menodai DNA. Dengan demikian, dapat digunakan untuk menodai setiap organisme yang mengandung DNA, atau, dengan kata lain, setiap sel yang dikenal.

Mengenai penggunaan khususnya dalam pita kromosom, Anda dapat merujuk ke banyak sumber online, seperti salah satu dari University of Washington ini:

Kromosom dalam metafase dapat diidentifikasi menggunakan teknik pewarnaan tertentu, yang disebut pita

(… )

G-band paling sering digunakan. Mereka mengambil nama mereka dari pewarna Giemsa, tetapi dapat diproduksi dengan pewarna lain. Pada pita-G, daerah gelap cenderung heterokromatik, bereplikasi terlambat, dan kaya AT. Daerah terang cenderung eukromatik, bereplikasi awal dan kaya GC.


Mungkin mereka menginginkan sesuatu seperti dari sini:

Untuk membedakan morfologi inti dan/atau sitoplasma dari trombosit, sel darah merah, sel darah putih dan parasit. Pada pewarnaan wright dan Giemsa: sitoplasma tampak biru dan nukleus relatif besar, terletak eksentrik dan berwarna merah. Kinetoplas yang berbeda, berbentuk batang, berwarna merah (struktur mitokondria khusus) mengandung DNA ekstranuklear yang disusun sebagai lingkaran mini dan lingkaran besar yang dikatate.

Menurut saya, pertanyaannya tidak tepat jika mereka menginginkan hal di atas. Seharusnya: Apa pewarnaan Giemsa pada kromosom? secara morfologis? jika hal di atas benar.

Itu adalah kursus biologi medis pertama jadi jawabannya harus dari itu.


Pewarnaan Giemsa: Prinsip, Prosedur, Hasil

Pewarnaan Giemsa adalah jenis pewarna Romanowsky, dinamai Gustav Giemsa, seorang ahli kimia Jerman yang menciptakan larutan pewarna. Hal ini terutama dirancang untuk demonstrasi parasit malaria dalam apusan darah, tetapi juga digunakan dalam histologi untuk pemeriksaan rutin apusan darah.

Kegunaan Pewarna Giemsa

  • Pewarnaan Giemsa digunakan untuk mendapatkan jumlah sel darah putih yang berbeda.
  • Ini juga digunakan untuk membedakan morfologi nuklir dan sitoplasma dari berbagai sel darah seperti trombosit, sel darah merah, sel darah putih.
  • Dalam Mikrobiologi, pewarnaan Giemsa digunakan untuk pewarnaan badan inklusi di Chlamydia trachomatis, Borrelia spesies, dan jika pewarnaan Wayson tidak tersedia, untuk diwarnai Yersinia pestis. Pewarnaan Giemsa juga digunakan untuk pewarnaan Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci, Klebsiella granulomatis, Talaromyces marneffei (sebelumnya disebut Penicillium marneffei) dan kadang-kadang kapsul bakteri.
  • Pewarnaan ini juga digunakan dalam sitogenetika untuk menodai kromosom dan mengidentifikasi aberasi kromosom. Biasanya digunakan untuk G-banding (Giemsa-Banding)

Prinsip pewarnaan Giemsa

Pewarnaan Giemsa adalah pewarna diferensial dan mengandung campuran pewarna biru, metilen biru, dan eosin. Ini khusus untuk gugus fosfat DNA dan menempel pada tempat yang memiliki jumlah ikatan adenin-timin yang tinggi.

Azure dan eosin adalah pewarna asam yang secara bervariasi menodai komponen dasar sel seperti sitoplasma, butiran, dll.

Metilen biru bertindak sebagai pewarna dasar, yang menodai komponen asam, terutama inti sel.

Metanol bertindak sebagai fiksatif serta pewarna seluler. Fiksatif tidak memungkinkan perubahan lebih lanjut dalam sel dan membuat mereka menempel pada slide kaca.

Komposisi pewarnaan Giemsa

PROSEDUR

A. Untuk persiapan pewarnaan internal:

  1. Timbang jumlah noda bubuk yang diperlukan, dan pindahkan ke botol berkapasitas 1 liter yang bersih dan kering. Tambahkan metanol dan aduk rata.
  2. Ukur dan tambahkan gliserol dan aduk rata.
  3. Tempatkan botol pewarna dalam penangas air pada 50-60 ° C atau pada 37 ° C hingga 2 jam dengan sering diaduk.
  4. Beri label pada botol dan simpan di tempat yang sejuk dan gelap dengan tutup yang kokoh.

CATATAN: Jika air terkena kontak selama langkah persiapan pewarna, noda akan rusak, oleh karena itu gunakan, keringkan barang pecah belah dan simpan dalam kondisi di mana tidak akan ada kontak air.

  • Saring noda menggunakan kertas saring Whatman no.1 dan encerkan dengan air yang disangga hingga pH 7,2 untuk membuat larutan yang berfungsi

B. Untuk pewarnaan slide

Cara pewarnaan, konsentrasi dan waktu pewarnaan berbeda-beda sesuai dengan tujuannya, misalnya sediaan apus darah tipis menggunakan pengenceran stok 1:20 sedangkan untuk sediaan apus darah kental pengenceran 1:50.

Untuk apusan darah tipis

  1. Perbaiki film kering udara dalam metanol absolut dengan mencelupkan film sebentar (dua celup) ke dalam stoples Coplin yang berisi metanol absolut.
  2. Angkat dan biarkan mengering.
  3. Pewarnaan dengan pewarna Giemsa encer (1:20, vol/vol) selama 20 menit (Untuk pengenceran 1:20, tambahkan 2 ml stok Giemsa ke 40 ml air buffer dalam stoples Coplin).
  4. Cuci dengan mencelupkan sebentar slide ke dalam dan keluar dari stoples Coplin berisi air buffer (satu atau dua celup).
    Catatan: Pencucian yang berlebihan akan menghilangkan warna film.
  5. Biarkan udara mengering dalam posisi vertikal. Amati di bawah mikroskop terlebih dahulu pada 40X dan kemudian menggunakan lensa minyak imersi

Untuk apusan darah kental

  1. Biarkan film mengering secara menyeluruh selama beberapa jam atau semalaman. Jangan mengeringkan film dalam inkubator atau dengan panas, karena ini akan memperbaiki darah dan mengganggu lisis sel darah merah.
    Catatan: Jika diagnosis cepat malaria diperlukan, film tebal dapat dibuat sedikit lebih tipis dari biasanya, dibiarkan kering selama 1 jam, dan kemudian diwarnai.
  2. JANGAN PERBAIKI.
  3. Pewarnaan dengan pewarna Giemsa encer (1:50, vol/vol) selama 50 menit (Untuk pengenceran 1:50, tambahkan 1 ml stok Giemsa ke dalam 50 ml air buffer dalam stoples Coplin)
  4. Cuci dengan menempatkan film dalam air buffer selama 3 sampai 5 menit.
  5. Biarkan udara kering dalam posisi vertikal dan amati di bawah mikroskop terlebih dahulu pada 40X dan kemudian menggunakan lensa minyak imersi

Untuk Chlamydia trachomatis

Ikuti langkah-langkah di atas tetapi dengan pengenceran noda encer 1:40 (tambahkan 0,5 ml larutan Giemsa stok ke 19,5 ml air buffer) dan biarkan noda selama 90-120 menit.


Karyotyping, Pewarnaan Giemsa - (26 Agustus 2014 )

Saya sedang mempersiapkan kromosom untuk kariotipe, karena saya perlu mengetahui jumlah kromosom organisme studi saya (semut).

Jadi saya hanya perlu menghitungnya.

Saya menggunakan protokol persiapan kromosom yang cocok untuk semut (termasuk pengobatan kolkisin) dan melakukan pewarnaan Giemsa standar.

Tapi saya tidak pernah melihat kromosom metafase yang jelas, mereka lebih seperti gelembung bulat dan mereka menempel sangat dekat satu sama lain, sehingga saya tidak bisa menghitungnya. 

Sekarang saya membaca bahwa Giemsa membuat kromosom menjadi besar. Mungkin jika kromosom saya sangat pendek, ini mengarah pada penampilan bulat mereka?

Saya tidak berpikir itu masalah dengan mikroskop, tetapi saya tidak yakin, karena gambar tidak terlalu jelas. (Saya memiliki perbesaran 1600x tersedia)

Adakah yang bisa merekomendasikan metode pewarnaan lain? Atau bantu aku juga?

Terima kasih banyak sebelumnya!

Pertama-tama, menurut saya foto Anda tidak fokus. Apakah Anda berpengalaman dalam menggunakan mikroskop? Sudahkah Anda menambahkan minyak imersi pada slide (lensa Anda terendam minyak, bukan?)? Namun demikian, saya menyarankan untuk membersihkan lensa objektif, panggung, dan iluminator dengan sangat baik.

Terlepas dari ini, Anda benar, metafase Anda menyebar dengan buruk dan kromosom tidak dalam keadaan baik. Saya dapat menyarankan beberapa hal tetapi semuanya didasarkan pada kultur sel manusia (tidak tahu apakah itu berlaku.) Untuk mendapatkan metafase yang tersebar dengan baik, saya sarankan bereksperimen dengan inkubasi ΚCL (inkubasi lebih lama). Saya menggunakan KCL yang sudah dihangatkan sebelumnya dan menambahkannya ke suspensi sel perlahan-lahan di bawah pusaran lembut.

Inkubasi mitogen juga dapat mempengaruhi penampilan kromosom dan jumlah metafase.

Hal lain yang mungkin mempengaruhi penampilan kromosom (kromosom memanjang) dan penyebaran metafase adalah kondisi penyebaran slide (kelembaban, suhu kamar, serta ketinggian dari sini Anda menjatuhkan suspensi sel Anda pada slide). Slide harus dingin (disimpan pada -20C dalam metanol). Menurut pengalaman saya, saya mendapatkan kromosom panjang yang tersebar dengan baik pada kelembaban sekitar 65%, pada suhu kamar kurang dari 22C. Waktu pengeringan tidak boleh terlalu lama. Anda dapat menggunakan pengering rambut (pada skala terendah) tetapi tidak menutup karena Anda akan menghancurkan kromosom (Anda harus bereksperimen dengan itu). Dengan meniup hanya pada sudut tertentu Anda juga dapat meningkatkan penyebaran metafase Anda. Slide juga tidak boleh terlalu cepat kering.

Anda juga harus ingat bahwa beberapa obat dan kondisi medis mempengaruhi struktur kromosom. Tapi saya kira ini tidak berlaku untuk kasus Anda.

Anda juga bisa menambahkan timidin dalam kultur sel Anda untuk mendapatkan kromosom yang memanjang.

Saya tidak tahu apakah saya membantu atau membingungkan Anda bahkan lebih tetapi penyebaran metafase adalah mencoba dan melihat sesuatu. Sebarkan slide satu per satu, catat semua kondisinya, periksa mikroskop. jika tidak berhasil buat beberapa perubahan dan coba lagi. Semoga beruntung! :) 

terima kasih banyak atas bantuan Anda!

Anda benar sekali, saya harus bekerja menggunakan mikroskop.

Ya, saya telah menambahkan minyak imersi pada slide.

Saya akan mencoba untuk membersihkan semuanya dan meningkatkan gambar.

Terima kasih atas semua saran Anda, saya pasti akan mencoba beberapa di antaranya. 

Masalah utamanya adalah, saya tidak bekerja dengan kultur sel.

Untuk persiapan kromosom, saya membedah semut jantan, mengisolasi testisnya dan menarik testis menjadi beberapa bagian untuk melepaskan sel (semuanya sudah terjadi di slide). 

Saya menginkubasi dalam larutan colchicine untuk menghentikan meiosis dalam metafase. 

KCl tidak termasuk dalam protokol saya, melainkan larutan hipotonik Na3Citrat x 2H2O

Apakah menurut Anda jenis larutan hipotonik membuat perbedaan?

Akibatnya, saya tidak menjatuhkan apa pun pada slide, karena testis sangat kecil sehingga saya pasti akan kehilangannya di dalam tabung.

Namun demikian, saya akan mencoba menyimpan slide dalam -20°C Metanol, seperti yang Anda sarankan.

Kelembaban adalah poin yang bagus juga, itu juga disebutkan dalam protokol yang saya gunakan, saya akan mencobanya juga.

Saya tidak yakin tentang 2 hal yang Anda sebutkan: mitogen dan timidin:

Saya tidak menggunakan mitogen apa pun, karena sel-sel di testis pria tetap membelah. 

Apakah Anda pikir saya harus menambahkannya ke protokol?

Sejauh yang saya tahu thymidin menghambat sintesis DNA, kan?

Karena saya sudah menggunakan colchicine untuk menahan metafase, saya tidak tahu apakah saya harus mencoba?

Setelah pengobatan colchicine, saya menggunakan tiga fiksatif yang berbeda secara bertahap: 2 campuran Etanol-GAA yang berbeda dan akhirnya GAA murni.

Kemudian saya menerapkan pewarnaan Giemsa standar. 

Jadi menurutmu bukan masalah nodanya tapi persiapan kromosomnya, kan?

Saya sangat berterima kasih atas bantuan Anda!

Saya tahu bahwa keinginan saya benar-benar berbeda dari kultur sel manusia, tetapi saya akan mencoba saran Anda!

Ya, berdasarkan pengalaman saya Giemsa tidak masalah. 

 Jenis larutan hipotonik seharusnya tidak penting secara hipotetis. Berhati-hatilah, karena inkubasi yang lama juga dapat menyebabkan hilangnya kromosom (metafase mungkin menyebar terlalu banyak sehingga tidak dapat menentukan jumlah kromosom/metafase secara akurat).  

Maaf, maksud saya inhibitor mitosis seperti colchicine. Saya telah memperhatikan bahwa inkubasi yang berkepanjangan, mempengaruhi jumlah metafase dan morfologi kromosom.

Timidin dan metotreksat serta faktor lainnya digunakan untuk mendapatkan kromosom yang memanjang (penting dalam analisis kariotipe dengan pita G atau R). Tapi saya pikir ini adalah hal terakhir yang harus dicoba. Seperti yang dapat saya pahami, Anda hanya ingin menghitung jumlah kromosom per metafase sehingga Anda tidak benar-benar perlu mendapatkan kromosom yang memanjang tetapi hanya metafase lengkap yang tersebar dengan baik.

Hal penting lain yang saya lupa sebutkan adalah waktu pewarnaan. Saya selalu membiarkan slide saya mengering selama 24 jam dan kemudian saya menodainya. Saya perhatikan bahwa saya mendapatkan kromosom yang "lebih cantik". Terkadang saya juga mengeringkannya pada suhu 90 C atau 65C selama 2-3 menit sebelum pewarnaan (Satu slide pada satu waktu, untuk menemukan yang terbaik..). 

Saya telah menemukan beberapa makalah di internet yang mungkin membantu Anda lebih dari saran saya, meskipun Anda mungkin sudah memilikinya karena mereka khusus untuk preparasi kromosom dari semut.

Sekali lagi terima kasih atas bantuan dan kertasnya!

Saya sebagian tahu kertasnya, protokol yang saya gunakan sebenarnya dari orang kertas ketiga, jadi sangat spesifik semut.

Ya, satu-satunya tujuan saya adalah menghitung kromosom, untuk mengetahui jumlah kromosom spesies. 


Alergi mata

Neal P Barney , . Frank M Graziano , dalam Penyakit Mata , 2010

Patofisiologi

Pewarnaan Giemsa dari kerokan dari konjungtiva tarsal atas akan mengungkapkan eosinofil. Eosinofil (yang tidak pernah ditemukan di jaringan normal) serta sejumlah besar sel mononuklear hadir di substansia propria di AKC. Eosinofil ini ditemukan memiliki peningkatan jumlah penanda aktivasi pada permukaannya. 42 Jumlah fibroblas meningkat dan terdapat peningkatan jumlah kolagen dibandingkan jaringan normal. Temuan ini kemungkinan penting untuk sifat penyakit yang mengancam penglihatan. Substantia propria juga menunjukkan peningkatan rasio sel T CD4+ terhadap CD8+, sel B, pewarnaan human leukocyte antigen (HLA)-DR, dan sel Langerhans. 39 Reseptor sel T pada limfosit di substansia propria sebagian besar adalah subtipe atau . 39 Populasi sel T dari substansia propria mencakup sel memori CD4+. 43 Sitokin Th2 mendominasi penyakit alergi namun limfosit dengan sitokin Th1 telah ditemukan di substansia propria pasien AKC. 44

Manifestasi laboratorium pada AKC ditunjukkan pada Tabel 13.2. Air mata pasien dengan AKC mengandung peningkatan jumlah antibodi IgE, ECP, sel T, sel B teraktivasi, eotaxin, eosinofil-derived neurotoxin (EDN), reseptor IL-2 terlarut, IL-4, IL-5, osteopontin, penghambatan makrofag faktor (MIF), dan penurunan nilai Schirmer (56% kurang dari 5 mm). 44-47 Sebuah respon imun seluler sistemik disfungsional ditunjukkan oleh pengurangan atau pembatalan dari respon yang diperantarai sel terhadap Kandidat, dan ketidakmampuan beberapa pasien untuk menjadi peka terhadap dinitrochlorobenzene. 48 Selain itu, penyimpangan respon imun bawaan disarankan oleh peningkatan insiden kolonisasi dengan Stafilokokus aureus. Isolasi dari S. aureus dari mata (konjungtiva, silia, margin kelopak mata) dari 80% pasien AKC (tetapi tidak dari pasien kontrol) telah dilaporkan. 49 Meskipun tidak diketahui sejauh mana hal ini berkontribusi pada peradangan permukaan mata, antibodi IgE spesifik terhadap S. aureus enterotoksin telah terdeteksi dalam air mata dari pasien AKC. 50 Selanjutnya, potensi S. aureus produk dinding sel untuk mengaktifkan epitel konjungtiva telah disarankan secara in vitro dalam penelitian yang melaporkan ekspresi dan aktivasi reseptor imun bawaan, Toll-like receptor-2 melalui ekstrak dari S. aureus dinding sel. 51 Immunostaining menunjukkan bahwa sel epitel konjungtiva dari pasien AKC mengekspresikan reseptor-2 mirip Tol secara signifikan lebih banyak daripada pasien nonalergi. Meskipun temuan in vivo ini, pasien AKC yang membaik dengan pengobatan tidak ditemukan memiliki perubahan tingkat kolonisasi dengan S. aureus bakteri. 52 Serum pasien AKC ditemukan mengandung peningkatan kadar IgE, 29 IgE terhadap toksin B stafilokokus, 52 ECP, 53 EDN, 54 dan reseptor IL-2. 55


Ikatan Kromosom..

Kita telah melihat bahwa kromosom adalah bentuk DNA yang dipadatkan. Kondensasi ini membutuhkan protein histon dan non-histon yang berbeda. Setiap kromosom memiliki ultrastruktur yang dapat direproduksi. Studi tentang kromosom disebut sitogenetika.

Gambar 1: Struktur Kromosom

Gambar-gambar kromosom sel yang diwarnai dapat difoto dan disusun menurut bentuk, struktur dan ukuran untuk membentuk kariogram. Ketika mengalami perlakuan yang berbeda sebelum pewarnaan, kromosom mengembangkan daerah gelap dan terang yang berbeda dalam bentuk: band. Pola pita dapat digunakan untuk mengidentifikasi kromosom homolog dan mendeteksi berbagai jenis kelainan penataan ulang kromosom.

Gambar 2: Prosedur pewarnaan kromosom (dengan Giemsa)

Ada berbagai teknik untuk mewarnai kromosom dan mencapai berbagai jenis pita. Berikut kami sebutkan beberapa di antaranya:

1. Pewarnaan Giemsa:

Giemsa adalah pewarna cahaya tampak, yang mengikat DNA melalui interkalasi. Pewarna cahaya tampak lebih stabil dan mampu menghasilkan pita yang lebih jelas daripada fluorokrom. Pewarnaan Giemsa merupakan campuran kationik pewarna tiazin dan anionik pewarna eosin seperti eosin Y.

Molekul pewarna tiazin positif lebih kecil dan dua molekul yang sama dengan cepat berinterkalasi ke dalam molekul DNA negatif, dan menodainya dengan warna biru. Molekul eosin anionik kemudian mengikat dua molekul tiazin dan mewarnai DNA menjadi ungu. Giemsa menodai daerah hidrofobik dengan lebih baik.

Ada empat jenis teknik banding yang berbeda, yang dapat dilakukan dengan menggunakan Giemsa: G-band, R-band, C-band & Tbandeng. Dalam setiap teknik pewarnaan yang disebutkan di atas, pewarnaan Giemsa menodai daerah yang berbeda karena perbedaan dalam pra-perawatan. Seperti yang kita semua tahu, protein histon tersebar merata di sepanjang kromosom. Protein non-histone tersebar di lokasi variabel dan bertanggung jawab atas keadaan longgar atau padat dari berbagai daerah kromosom. Daerah yang padat atau eukromatin daerah dan daerah padat adalah heterokromatin daerah. Proses pra-perawatan secara berbeda mengekstraksi protein-protein ini yang menghasilkan daerah-daerah bernoda berbeda.

Ini adalah metode pita yang paling umum digunakan untuk analisis sitogenetik menggunakan pewarnaan Giemsa. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Dr. Marina Seabright pada tahun 1971.

Gambar 3: Dr. Marina Seabright

(Sumber Gambar dan informasi lebih lanjut tentang Dr. Marina Seabright di sini)

Sel-sel tertahan dalam metafase, membengkak (menjadi turgid), terfiksasi, jatuh dan pecah. Kemudian sebaran kromosom dikeringkan dengan udara dan kromosom diolah terlebih dahulu sebelum pewarnaan Giemsa (Gambar 2 secara rinci pada posting sebelumnya).

Perawatan awal:

Selama G-banding standar, kromosom diperlakukan secara ringan dengan enzim proteolitik (tripsin) sebelum diwarnai dengan Giemsa. Pewarnaan G-band protokol standar ketika diikuti memberikan sekitar 400 dan 600 pita untuk dilihat pada kromosom metafase.

Dua jenis pita yang diamati adalah

• G-band positif:

Pita G positif adalah pita bernoda gelap. Daerah ini bersifat hidrofobik, dan mendukung pembentukan endapan tiazin-eosin. Hidrofobisitas disebabkan oleh protein hidrofobik. Protein sulit diekstraksi karena memiliki lebih banyak ikatan silang disulfida (Gambar 4). Protein ini membuat daerah lebih padat. Mereka membentuk replikasi yang terlambat heterokromatin dan umumnya kaya AT wilayah.

Gambar 4: Ikatan disulfida dan gugus sulfhidril

• G-band negatif:

Pita bernoda ringan disebut pita G negatif. Daerah ini kaya akan dasar GC berpasangan. Ini adalah replikasi awal eukromatin dan kurang kental. Protein yang mengikat daerah ini memiliki lebih banyak sulfhidril (gbr 4) dan mudah dilepas selama pretreatment. Daerah ini kurang hidrofobik dan kurang menguntungkan untuk pembentukan endapan tiazin-eosin.

Gambar 5: Kariotipe Manusia (Wanita) Normal. (Sumber: Thirumulu Ponnuraj, Kannan. (2011). Teknik Sitogenetik dalam Mendiagnosis Gangguan Genetik)

Teknik pita ini mengungkapkan Eukromatin kaya GC dan menghasilkan pita positif yang sesuai dengan pita G negatif dan sebaliknya. Ini memberikan hasil membalikkan dari standar G-banding.

Dalam teknik ini, pita diproduksi oleh kromosom metafase di buffer fosfat panas (

87°C) sebelum diwarnai dengan pewarnaan giemsa. Inkubasi menyebabkan denaturasi daerah AT kromosom karena titik leleh yang rendah dari daerah ini (

65 ° C) dibandingkan dengan wilayah GC (

R-banding membantu menganalisis struktur ujung kromosom, yang berwarna terang dengan G-banding tetapi lebih gelap dengan R-Banding.

Gambar 6: Kromosom 1: G-banding, diagram dan R-banding – (Sumber Gambar: Claude Léonard, Jean-Loup Huret Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology)

Noda C-banding heterokromatin konstitutif yang ada di sekitar sentromer dari semua kromosom manusia, dan paling melimpah di sekitar sentromer kromosom manusia 1, 9, 16 dan lengan panjang distal kromosom Y.

Pra-perawatan:

Pretreatment melibatkan tiga langkah berturut-turut pengobatan dengan asam (HCl), diikuti dengan pengobatan basa (barium hidroksida) dan akhirnya pengobatan dengan garam panas [saline-natrium sitrat (SSC)]. Pengobatan dengan asam (HCl) membawa penghapusan purin. Perlakuan basa (barium hidroksida atau Sodium borohidrida) mengurangi gula apurinasi. Pemutusan rantai pada situs yang mengalami depurinasi terjadi selama pengobatan dengan larutan garam panas [60 ° C, saline-natrium sitrat (SSC)]. Dalam perawatan terakhir ini, situs dengan urutan yang sangat berulang menahan kerusakan dan diregenerasi. Juga situs dengan protein yang memiliki interaksi kuat dilindungi. Oleh karena itu, situs yang dilindungi oleh protein atau memiliki urutan yang sangat berulang seperti sentromer menjadi ternoda.

Gambar 7: (a) kariotipe pita-G dari Bradypus torquatus jantan (2n = 50) (b) kariotipe pita-C dari Bradypus torquatus jantan. (Sumber Gambar: Azevedo N et. al. (2012). Biologi evolusioner BMC. 12. 36.)

T-banding melibatkan pewarnaan telomer daerah kromosom. Kromosom (slide) diinkubasi dalam buffer fosfat atau PBS pada suhu 87°C diikuti dengan pewarnaan dengan larutan Giemsa atau jeruk akridin(OA). T-band adalah daerah tahan panas, terutama kaya akan pasangan C-G. Mereka membentuk sekitar 15% dari semua pita tetapi mengandung sekitar 65% dari semua gen yang dipetakan.

Gambar 8: T-banding

Teknik banding menggunakan noda lain:

mustard quinacrine adalah agen alkilasi yang berfluoresensi terang di bawah sinar UV. Pita ini terlihat di bawah a mikroskop fluoresensi. Pita fluoresensi terang dan redup yang berselang-seling disebut pita Q. Pita terang adalah wilayah kaya AT dan pita kusam adalah wilayah kaya GC (mirip dengan pita G). Pita Q berguna dalam membedakan kromosom Y manusia dan berbagai polimorfisme kromosom yang melibatkan: satelit dan sentromer dari kromosom tertentu.

Gambar 9: Q-banding

NOR pita

Pengikatan NOR melibatkan pewarnaan “wilayah pengorganisasian nukleolar” dengan pewarnaan perak (larutan perak nitrat). NOR mengandung gen rRNA. Diperkirakan bahwa perak nitrat menempel pada protein nukleolar dan bukan rDNA itu sendiri. Pada manusia, NOR ditemukan pada lengan pendek kromosom 13, 14, 15, 21 dan 22, masing-masing gen RNR1, RNR2, RNR3, RNR4, dan RNR5. Mereka mengkode 5.8S, 18S, dan 28S rRNA. Pewarnaan perak biasanya menodai gen rRNA yang aktif secara transkripsi. Perubahan jumlah dan ukuran NOR membantu menjelaskan perubahan aktivitas transkripsi di lingkungan dan kondisi yang berbeda.

Gambar 10: NOR bernoda

(Sekedar info:Baca bagaimana teknik pita memungkinkan untuk menemukan diversifikasi spesies ikan

Pewarnaan DAPI/Distamycin A:

Ini adalah teknik pewarnaan fluoresen untuk memberi label pada subset tertentu dari C band. Pewarnaan DAPI/Distamycin A digunakan untuk mengidentifikasi breakpoint peri-sentromer dalam penyusunan ulang kromosom dan kromosom yang terlalu kecil untuk teknik pita standar.

4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) adalah fluorokrom spesifik-AT yang mengikat DNA. yang memberikan fluorosensi biru. Distamycin A adalah antibiotik oligopeptida spesifik AT yang mengikat DNA. Pretreatment Distamycin A menghasilkan penurunan fluoresensi dengan pewarnaan DAPI, yang memungkinkan hanya beberapa daerah tertentu dari heterokromatin konstitutif untuk berfluoresensi cerah.

Gambar 11: Perbandingan antara pewarnaan DAPI dan DAPI/Distamycin A saja.

Pita terang ini meliputi penyempitan kromosom 1, 9 dan 16, lengan pendek kromosom 15, dan bagian distal dari Y.

Oleh karena itu teknik pita yang berbeda membantu dalam pewarnaan daerah tertentu gelap atau terang. Daerah ini dapat dibandingkan dengan kromosom homolog atau kromosom dari individu atau spesies yang berbeda untuk mendapatkan informasi tentang penyakit, evolusi dan keturunan.

Ini semua untuk posting ini. Semoga Anda menyukai posting ini, jika ya, silakan beri komentar, suka, dan bagikan !!

Ikuti juga kami di Facebook, Twitter, Instagram atau kirim email ke [email protected]

Baca juga postingan lain dari The Biotech Notes:

Untuk Siswa mempersiapkan CSIR-JRF-NET (Kehidupan Sains, India), berikut adalah beberapa buku dengan ulasan bagus.

(Sumber gambar: Gambar 8: pita T Gambar 9: pita Q Gambar 10: NOR yang diwarnai Gambar 11: Pewarnaan DAPI (Thermofisher) dan DAPI/Distamycin A)


Apa itu Pewarna Giemsa? (dengan gambar)

Pewarnaan Giemsa adalah campuran pewarna standar yang membuat berbagai jenis sel terlihat jelas pada apusan darah atau irisan tipis jaringan. Noda ini dinamai ahli kimia Jerman, Gustav Giemsa, yang pertama kali mengembangkannya untuk karyanya dalam mempelajari parasit yang menyebabkan malaria — Plasmodium. Untuk memastikan teknisi yang memeriksa sampel dapat memperoleh pembacaan yang akurat, langkah-langkah prosedur pewarnaan harus distandarisasi serta campuran pewarna. Pewarnaan Giemsa disebut pewarnaan diferensial karena menghasilkan warna yang berbeda tergantung pada ikatannya, seperti sitoplasma atau DNA.

Formula pewarnaan Giemsa telah disesuaikan dari waktu ke waktu untuk meningkatkan stabilitas pewarna dan warna yang dihasilkan. Campuran standar saat ini termasuk metilen biru, eosin, dan kadang-kadang biru langit B. Pewarna ini sering disimpan dalam bentuk bubuk kering dan dicampur dengan air sebelum digunakan. Jika air ada dalam campuran pewarna sebelum digunakan, beberapa senyawa akan teroksidasi dan noda salah.

Langkah-langkah yang tepat dari prosedur untuk menggunakan pewarnaan Giemsa dapat bervariasi tergantung pada organisme atau jenis sel sampel yang diperiksa serta komposisi sampel itu sendiri. Sampel yang akan diwarnai menggunakan pewarna Giemsa biasanya dioleskan pada, atau ditempelkan pada, slide segera setelah diambil. Apusan darah tipis umumnya difiksasi dengan cara dicelupkan ke dalam metanol, sedangkan apusan darah tebal dibiarkan kering sepenuhnya pada suhu kamar. Slide kemudian direndam dalam noda selama beberapa waktu dan kemudian dibilas dengan air yang memiliki pH netral. Slide dibiarkan mengering sebelum dilihat.

Karena pewarnaan diferensial yang dihasilkan oleh pewarnaan Giemsa,Plasmodium sitoplasma berwarna biru muda sedangkan DNA tampak merah atau ungu. Parasit lain, Giardia lamblia, berwarna merah muda-ungu kecuali DNA, yang berwarna biru sangat tua. Histoplasma capsulatum, jamur, ditemukan dalam bentuk ragi dalam sel darah putih manusia dan berwarna biru tua.

Proses pewarnaan ini juga membantu dalam studi kromosom dan dalam memvisualisasikan perbedaan antara berbagai sel darah. Sebuah kromosom berwarna biru sangat gelap di beberapa bagian dan biru muda di bagian lain. Hal ini menyebabkan efek pita yang membantu ahli genetika menemukan tempat di mana kromosom telah mengalami perubahan yang tidak biasa. Sel darah merah berwarna merah muda, sedangkan butiran dalam sel mast muncul sebagai bintik ungu. Sel darah putih menodai berbagai warna biru, memungkinkan berbagai jenis — basofil, eosinofil, neutrofil, dan lainnya — untuk dibedakan satu sama lain.


Apa itu Pita Kromosom? (dengan gambar)

Pita kromosom adalah pita melintang yang muncul pada kromosom sebagai hasil dari berbagai teknik pewarnaan diferensial. Pewarnaan diferensial memberikan warna pada jaringan, sehingga dapat dipelajari di bawah mikroskop. Kromosom adalah struktur seperti benang dari filamen asam deoksiribonukleat (DNA) panjang, yang melilit menjadi heliks ganda dan terdiri dari informasi genetik, atau gen, yang disusun secara melintang di sepanjang.

Untuk menganalisis kromosom di bawah mikroskop, mereka perlu diwarnai ketika mereka menjalani pembelahan sel selama meiosis atau mitosis. Mitosis dan meiosis adalah proses pembelahan sel yang dibagi menjadi empat fase. Fase-fase tersebut adalah profase, metafase, anafase, dan telofase.

Kritogenetik adalah ilmu yang mempelajari fungsi sel, struktur sel, DNA, dan kromosom. Ini menggunakan berbagai teknik untuk pewarnaan kromosom, seperti G-banding, R-banding, C-banding, Q-banding, dan T-banding. Setiap teknik pewarnaan memungkinkan para ilmuwan untuk mempelajari berbagai aspek pola pita kromosom.

Giemsa banding, juga dikenal sebagai G-banding, memungkinkan para ilmuwan untuk mempelajari kromosom dalam tahap metafase mitosis. Metafase adalah tahap kedua mitosis. Pada fase ini kromosom berjejer dan menempel pada pusat atau sentromernya, dan setiap kromosom muncul dalam bentuk bentuk X.

Sebelum menerapkan pewarnaan pada kromosom, mereka harus terlebih dahulu diperlakukan dengan: tripsin, yang merupakan cairan pencernaan yang ditemukan pada banyak hewan. Tripsin akan mulai mencerna kromosom, memungkinkan mereka untuk menerima pewarnaan Giemsa dengan lebih baik. Pewarnaan Giemsa ditemukan oleh Gustav Giemsa, dan merupakan campuran dari metilen biru dan pewarna asam merah, eosin. Penggunaan Q-banding kinikrin, yang merupakan solusi jenis mustard. Ini menghasilkan hasil yang sangat mirip dengan Giemsa, tetapi memiliki kualitas fluorescent.

DNA terdiri dari empat asam basa yang muncul berpasangan - adenin berpasangan dengan timin, dan sitosin dengan guanin. Pewarnaan Giemsa menciptakan pola pita kromosom dengan area gelap yang kaya akan adenin dan timin. Daerah terang kaya dengan guanin dan sitosin. Area-area ini mereplikasi lebih awal dan eukromatik. Euchromatic adalah area yang aktif secara genetik yang nodanya sangat ringan dengan perawatan pewarna.

Reverse-banding, atau R-banding, menghasilkan pola pita kromosom yang merupakan kebalikan dari G-banding. Daerah yang lebih gelap kaya dengan guanin dan sitosin. Ini juga menghasilkan bagian eukromatik dengan konsentrasi tinggi adenin dan timin.

Dengan C-banding, pewarnaan Giemsa digunakan untuk mempelajari heterokromatin konstitutif dan sentromer kromosom. Heterokromatin konstitutif adalah area di dekat pusat kromosom yang mengandung DNA yang sangat padat yang cenderung diam secara transkripsi. Sentromer adalah daerah di bagian paling tengah dari kromosom.

T-banding memungkinkan para ilmuwan untuk mempelajari telomer dari sebuah kromosom. Telomer adalah topi yang ada di masing-masing kromosom. Mereka mengandung DNA berulang dan dimaksudkan untuk mencegah terjadinya kerusakan.

Setelah kromosom diwarnai dengan Giemsa, peneliti dapat dengan jelas melihat pola pita kromosom gelap dan terang bergantian yang dihasilkan. Dengan menghitung jumlah pita, kariotipe suatu sel dapat ditentukan. Kariotipe adalah karakterisasi kromosom untuk suatu spesies menurut ukuran, jenis, dan jumlah.


Isi

Ini spesifik untuk gugus fosfat DNA dan menempel pada daerah DNA di mana terdapat ikatan adenin-timin dalam jumlah tinggi. Pewarnaan Giemsa digunakan dalam pita Giemsa, biasa disebut pita-G, untuk mewarnai kromosom dan sering digunakan untuk membuat kariogram (peta kromosom). Ini dapat mengidentifikasi penyimpangan kromosom seperti translokasi dan penataan ulang. [ kutipan diperlukan ]

Ini menodai trofozoit Trichomonas vaginalis, yang muncul dengan pelepasan kehijauan dan sel motil pada persiapan basah. [ kutipan diperlukan ]

Pewarnaan Giemsa juga merupakan pewarnaan diferensial, seperti bila dikombinasikan dengan pewarnaan Wright untuk membentuk pewarnaan Wright-Giemsa. It can be used to study the adherence of pathogenic bacteria to human cells. It differentially stains human and bacterial cells purple and pink respectively. It can be used for histopathological diagnosis of the Plasmodium species that cause malaria [2] and some other spirochete and protozoan blood parasites. It is also used in Wolbachia cell stain in Drosophila melanogaster. [ kutipan diperlukan ]

Giemsa stain is a classic blood film stain for peripheral blood smears and bone marrow specimens. Erythrocytes stain pink, platelets show a light pale pink, lymphocyte cytoplasm stains sky blue, monocyte cytoplasm stains pale blue, and leukocyte nuclear chromatin stains magenta. It is also used to visualize the classic "safety pin" shape in Yersinia pestis.

Giemsa stain is also used to visualize chromosomes. This is particularly relevant for detection of Cytomegalovirus infection, where the classical finding would be an "owl-eye" viral inclusion. [3]

Giemsa stains the fungus Histoplasma, Klamidia bacteria, and can be used to identify mast cells. [4]

Giemsa's solution is a mixture of methylene blue, eosin, and Azure B. The stain is usually prepared from commercially available Giemsa powder.

A thin film of the specimen on a microscope slide is fixed in pure methanol for 30 seconds, by immersing it or by putting a few drops of methanol on the slide. The slide is immersed in a freshly prepared 5% Giemsa stain solution for 20–30 minutes (in emergencies 5–10 minutes in 10% solution can be used), then flushed with tap water and left to dry. [5]


Sequence organization was revealing by heating DNA to a single-stranded state then allowing the DNA to reanneal by cooling.
This revealed several types of repetitive DNA.
Multiple "copies" of similar functional repetitive sequences can be described as dispersed gene families (globin genes, actins, tubulins).
Non-functional copies of genes are known as pseudogenes.
Tandem gene family arrays are made up of multiple copies of the same gene all next to each other (such as histones).
The nucleolar organizer, which is cytologically distinct, is a tandem array of genes that encode ribosomal RNA.
Noncoding functional sequences, such as the short tandem repeats that act to maintain the telomeres at the ends of a linear chromosome.

There are a number of sequences with no known function include
1) Highly repetitive centromeric DNA including satellite DNA.
2) Variable number tandem repeats (VNTRs) or minisatellite DNA which provide the differences in DNA used in DNA fingerprinting.
3) Microsatellites, regions of dinucleotide repeats

Transposed sequences are "jumping genes" that are dispersed throughtout the genome.
Transposons move as DNA elements and retrotransposons move via an RNA intermediate which is reverse transcribed and reinerted into the genome.
Examples of a retrotransposons include the 1-to 5 kilobase Long interspersed elements (LINES) and the much smaller (>200 basepairs) short interspersed elements (SINES)
Such as the human Alu sequences.
The presence of these various elements provides a great deal of variety to the spacing and locations of genes in the genomes of organisms.


The involvement of nucleosomes in Giemsa staining of chromosomes. A new hypothesis on the banding mechanism

A new hypothesis is proposed on the involvement of nucleosomes in Giemsa banding of chromosomes. Giemsa staining as well as the concomitant swelling can be explained as an insertion of the triple charged hydrophobic dye complex between the negatively-charged super-coiled helical DNA and the denatured histone cores of the nucleosomes still present in the fixed chromosomes. New cytochemical data and recent results from biochemical literature on nucleosomes are presented in support of this hypothesis. Chromosomes are stained by the Giemsa procedure in a purple (magenta) colour. Giemsa staining of DNA and histone (isolated or in a simple mixture) in model experiments results in different colours, indicating that a higher order configuration of these chromosomal components lies at the basis of the Giemsa method. Cytophotometry of Giemsa dye absorbance of chromosomes shows that the banding in the case of saline pretreatment is due to a relative absence of the complex in the faintly coloured bands (interbands). Pretreatment with trypsin results in an increase in Giemsa dye uptake in the stained bands. Cytophotometric measurements of free phosphate groups before and after pretreatment with saline, reveal a blocking of about half of the free phosphate groups indicating that a substantial number of free amino groups is still present in the fixed chromosomes. Glutaraldehyde treatment inhibited Giemsa-banding irreversibly while the formaldehyde-induced disappearance of the bands could be restored by a washing procedure. These results correlate with those of biochemical nucleosome studies using the same aldehydes. Based on these findings and on the known properties of nucleosomes, a mechanism is proposed that explains the collapse of the chromosome structure when fixed chromosomes are transferred to aqueous buffer solutions. During homogeneous Giemsa staining reswelling of the unpretreated chromosome is explained by insertion of the hydrophobic Giemsa complex between the hydrophobic nucleosome cores and the superhelix DNA. Selective Giemsa staining of the AT-enriched bands after saline pretreatment is thought to be due to the, biochemically well-documented, higher affinity of arginine-rich proteins present in the core histones for GC-enriched DNA, which prevents the insertion of the Giemsa complex in the interbands. Production of Giemsa bands by trypsin pretreatment can be related to the action of this enzyme on the H1 histones and subsequent charge rearrangements.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)


Giemsa banding (GTG, GTW, GAG, GTL)

The introduction of Giemsa banding (G‐bands) in 1971 by Sumner et al. was another major advance in the field of cytogenetics. It eliminated the need for an expensive fluorescence photomicroscope and provided permanently stained slides with very high‐resolution bands. Today, Giemsa banding (or similar Romanowsky dyes) is the most widely utilized staining technique for chromosome analysis.

In human chromosomes, the 30‐nm fiber of DNA forms loops of approximately 75–100 kb, which are tethered or anchored at their bases to form what is known as a chromosome scaffold. This structure can be seen by removing most histones and non-histones from the chromosomes and surface‐spreading them appropriately for electron microscopy. The residual structure appears as a scaffold, with numerous and extensive loops of DNA radiating from a coarsely fibrous structure that resembles a metaphase chromosome. The final packaging of the 30‐nm fiber of DNA into chromosomes results in a 10,000‐fold reduction in DNA length. Fixation in 3 : 1 methanol‐acetic acid is an important preliminary step for G‐banding. Fixation extracts a portion of all histones, especially H1, and a group of non-histones in the 50,000‐ to 70,000‐dalton (Da) range, but it is far from a complete removal of proteins. The crosslinking data indicated that the conformation of chromosomal proteins in relation to DNA strongly influences banding.

Giemsa stain is a complex mixture of dyes that may vary in concentration, purity, and ratio. The main components are the basic aminophenothiazine dyes – azure A, azure B, azure C, thionin, and methylene blue‐and the acidic dye, eosin. The thiazin dyes vary in the number of methyl groups attached to a core of two benzene rings bound together by nitrogen and a sulfur atom. Several studies have been done concerning the band‐producing ability of the individual components of Giemsa stain. Methylene blue or any of the azures alone produces banding.

Chromatin is divided into two main groups: heterochromatin and euchromatin. Constitutive heterochromatin is highly condensed, very repetitive, and transcriptionally inactive during interphase, in order for gene transcription to occur. One type of euchromatin, facultative heterochromatin, behaves like heterochromatin in a developmentally controlled manner, being transcriptionally inactive, late replicating, and condensed during interphase. The inactive X chromosome in the somatic cells of female mammals is an example of facultative heterochromatin.

G banding requires methanol/acetic acid‐fixed cells spread onto slides cytoplasmic background interferes with good G‐bands, so proper cell dilution and spreading is essential. Slides are sufficiently dried (for 2–4 days at room temperature), or baked at low temperatures (e.g., 60 °C) for 2–18 hours, or high temperatures (e.g., 90–95 °C) for 20–60 minutes to dehydrate them (see Table 6.4). Slides that are insufficiently “aged” by natural means or by heating will not respond at all to the trypsin, no matter how long it is applied, and the chromosomes will appear unbanded.

Tripsin exposure depends on its brand, concentration, and temperature, but may also be affected by preparation and working conditions. Recrystallized forms have a higher level of activity, thereby requiring less time or a lower concentration. A stock trypsin solution can be prepared in advance, and small aliquots can be frozen until needed. At lower temperatures, the working solution has decreased activity. Higher pH (approximately 8) and higher temperature increase the enzymatic action of the trypsin and may be useful with cells that appear to be resistant to standard concentrations. Exposing slides to trypsin in a vertical fashion (rather than horizontal) may enhance its activity slightly.

A fetal bovine serum rinse is helpful in stopping the action of the trypsin. Serum contains alpha‐1‐antitrypsin, which inhibits the trypsin by complexing it with the protein in the serum. Other rinses that are commonly used include pH 8.0 buffer, 0.85% (normal) saline, Hanks’ balanced salt solution (HBSS), and 70% ethanol.

Determination of G‐banded chromosome resolution

As a rule, the better the banding resolution is, the better will be the chance of finding a small chromosome abnormality. This rule is more reliable for deletions and duplications than for centromere displacement (inversions, neocentromeres) because the constriction of the centromere becomes more difficult to visualize as the chromosomes become longer and thinner. However, there is a need to quantify the banding resolution of a given cell (on the analysis sheet) or chromosome study (on the final report) so that the limits of resolution can be inferred. There are several methods for determination of band levels.

The Vancouver method involves counting bands in segments for some chromosomes (e.g., chromosomes 1, 11, and 12) and all bands in others (chromosomes 10 and X). Count only G‐positive bands and do not count the centromere. Total the bands then look at a chart that has increments of 50 bands at the lower range and 100 bands at the higher end to determine haploid band resolution.

KromosomResolution 350Resolution 450Resolution 550Resolution 850
1p31-p321133
10551219
11p2256
12q45814
x681218
Total18214060
Haploid band resolution determination by the Vancouver method

Johnson and Stallard method

Johnson and Stallard used a method that quantifies the number of light and dark G‐bands present on one chromosome 10. Some laboratories account for a difference in resolution between the two chromosome 10 homologues in a cell by counting both homologues and dividing the total by 2 before using the haploid parameters.

No of bands presentHaploid banding level
12375
13-14400
15-16425
17-18450
19-21475
22-23500
24-25525
26-28550
29575
30600
31625
32650
33675
34700
35725
36750
37775
38800
39825
40-41850
Haploid band resolution determination using chromosome 10 by the Johnson and Stallard method

Welborn method

The Welborn method involves counting all dark and light bands on one homologue each of chromosomes 1 and 2, counting the centromere as a band in each arm. Total the bands from both chromosomes and then multiply by 6 to get the haploid band resolution, since chromosomes 1 and 2 represent 1/6 of the genome.


Tonton videonya: What is G-BANDING? What does G-BANDING mean? G-BANDING meaning, definition u0026 explanation (Agustus 2022).