Informasi

Memahami fungsi saturasi dalam Model Monod-Wyman-Changeux

Memahami fungsi saturasi dalam Model Monod-Wyman-Changeux



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya sedang membaca Fisiologi Matematika, Sneyd. Saya seorang ahli matematika sarjana yang tertarik untuk mengejar bidang ini, jadi maafkan saya jika terminologi saya salah. Dalam contoh ini, penulis menganggap protein dengan dua situs pengikatan. Subskrip $i$ menunjukkan jumlah ligan terikat. Ekspresi ini, yang disebut fungsi saturasi, muncul di halaman 18:

$$Y = frac{r_1 + 2r_2 + t_1 + 2t_2}{2(r_0+r_1 + r_2 + t_0 + t_1 + t_2)}$$

Dimana, $r_i, t_i$ masing-masing menunjukkan konsentrasi spesies kimia $R_i, T_i$.
Sepertinya rata-rata tertimbang dari ezim yang telah menempati situs pengikatan.

Fakta bahwa $t_0, r_0$ tidak muncul dalam pembilang menunjukkan bahwa itu adalah saturasi situs pengikatan enzim, $2$ di depan $r_2,t_2$ menunjukkan bahwa enzim dengan kedua situs pengikatan terisi "konsentrasi ganda ". Dua pada penyebut menunjukkan jumlah situs pengikatan yang tersedia dalam enzim. Mungkin, jika kita mempertimbangkan enzim dengan tiga situs pengikatan:

$$Y = frac{r_1 + 2r_2 + 3r_3 + t_1 + 2t_2 + 3t_3}{3(r_0+r_1 + r_2+ r_3 + t_0 + t_1 + t_2 + t_3)}$$

Apakah deskripsi ini benar?


Saya tidak memiliki akses ke Fisiologi Matematika Sneyd, tetapi dalam deskripsi Wikipedia tentang model Monod-Wyman-Changeux, mereka menyebut Y "hunian pecahan dari situs pengikatan ligan". Referensi lain menyebutnya sebagai "kejenuhan fraksional".

Dengan kata lain, itu hanyalah sebagian kecil dari situs pengikatan yang saat ini memiliki ligan yang terikat padanya. Penyebut, kemudian, adalah jumlah total situs pengikatan, yang setara (untuk satu unit volume) dengan konsentrasi total protein (yaitu jumlah setiap bentuk protein) dikalikan jumlah situs pengikatan per protein.

Pembilangnya adalah bilangan terikat ligan situs yang mengikat. Yang setara (untuk satu satuan volume) dengan konsentrasi setiap bentuk, dikalikan dengan jumlah ligan yang terikat padanya. Jadi bentuk ligan nol dikalikan dengan nol, bentuk ligan satu dikalikan satu, bentuk ligan dua dikalikan dua, dll. (Ini tidak mencerminkan "konsentrasi ganda", melainkan mencerminkan stoikiometri: untuk setiap molekul protein dalam keadaan terikat 2, ada dua molekul ligan yang terikat padanya.)

Jadi jawaban untuk pertanyaan kotak Anda adalah ya: itu akan menjadi bentuk yang tepat untuk protein kooperatif dengan tiga situs pengikatan.


50 tahun interaksi alosterik: liku-liku model

Konsep interaksi tidak langsung atau 'alosterik' antara situs topografi yang berbeda, dan model 1965 Monod-Wyman-Changeux (MWC) berikutnya untuk perubahan konformasi yang memediasi mereka, muncul sekitar 50 tahun yang lalu. Banyak protein pengatur klasik (termasuk hemoglobin, Asp transcarbamylase dan reseptor asetilkolin nikotinat) mengikuti paradigma sentral model MWC, yang telah diperluas dan ditantang sebagai hasil dari teknologi baru. Yang penting, konsep interaksi alosterik telah membantu pemahaman kita tentang penyakit manusia dan desain obat.


Diseksi kimia resolusi tinggi dari model eukariota mengungkapkan target, jalur, dan fungsi gen

Karena konservasi evolusioner biologi, pengetahuan eksperimental yang diambil dari studi genetik pada organisme model eukariotik memberikan wawasan tentang jalur seluler manusia dan akhirnya fisiologi. Profil kemogenomik ragi adalah pendekatan yang kuat untuk menjelaskan respons seluler terhadap molekul kecil. Menggunakan platform yang dioptimalkan, kami memberikan sensitivitas relatif dari koleksi penghapusan heterozigot dan homozigot untuk hampir 1800 senyawa aktif biologis. Kualitas data memungkinkan wawasan unik ke dalam jalur yang sensitif dan tahan terhadap gangguan tertentu, seperti yang ditunjukkan dengan senyawa yang dikenal dan baru. Kami menyajikan contoh senyawa baru yang menghambat sintase asam lemak dan desaturase yang relevan secara terapeutik (Fas1p dan Ole1p), dan menunjukkan bagaimana profil individu memfasilitasi eksperimen yang didorong oleh hipotesis untuk menggambarkan mekanisme aksi senyawa. Yang penting, skala dan keragaman senyawa yang diuji menghasilkan kumpulan data di mana jumlah jalur termodulasi mendekati saturasi. Sumber daya ini dapat digunakan untuk memetakan koneksi biologis baru, dan juga mengidentifikasi fungsi untuk gen yang tidak bernotasi. Kami memvalidasi hipotesis yang dihasilkan oleh pengelompokan profil hierarkis dua arah global untuk (i) senyawa baru dengan mekanisme aksi serupa yang bekerja pada mikrotubulus atau ATPase vakuolar, dan (ii) ORF yang tidak beranotasi, YIL060w, yang berperan dalam respirasi dalam mitokondria. Akhirnya, kami mengidentifikasi dan mengkarakterisasi mutasi latar belakang dalam koleksi penghapusan ragi yang banyak digunakan yang seharusnya meningkatkan interpretasi layar masa lalu dan masa depan di seluruh komunitas. Sumber daya respons seluler yang komprehensif ini memungkinkan perluasan pemahaman kita tentang biologi jalur eukariotik.

Kata kunci: Profil kemogenomik Cmpd FAS HIP HIP HOP profiling HOP Mekanisme aksi MoA Identifikasi target Senyawa ragi asam lemak sintase profil insufisiensi profil homozigot mekanisme aksi.


Karakterisasi Fisiologi Hemoglobin Ditinjau dari p50 dan n

Kurva saturasi hemoglobin (Gbr. 1 A) biasanya dicirikan secara empiris dalam hal tekanan parsial oksigen di mana hemoglobin setengah jenuh, biasanya dilambangkan sebagai p50, dan kooperatifitas kurva saturasi pada titik setengah jenuh, dilambangkan sebagai n. Telah lama diketahui bahwa kurva saturasi hemoglobin adalah sigmoidial, yang mencerminkan kooperatifitas dalam pengikatan oksigen (16, 17). Pengukuran ekstensif menunjukkan variasi p50 (18, 19) pada mamalia dari 20–40 mm Hg, sementara n bervariasi dalam kisaran 2 hingga 3,5. Dengan demikian, kedua parameter telah dimodifikasi selama evolusi, mungkin di bawah tekanan selektif yang kuat. Misalnya p50 menurun dengan berat hewan (18, 19), biasanya dijelaskan oleh kebutuhan metabolisme basal yang berbeda.

Kurva saturasi hemoglobin dan model MWC. (A) Kurva saturasi oksigen menggambarkan proporsi gugus heme yang terikat pada oksigen sebagai fungsi dari tekanan parsial oksigen. Titik setengah jenuh, p50, adalah tekanan parsial di mana setengah dari situs ditempati. Kerjasama n mengukur sejauh mana perubahan tekanan parsial oksigen mempengaruhi tingkat kejenuhan. Ini ditunjukkan secara skema di sini meskipun sebenarnya didefinisikan sebagai kemiringan di plot Bukit [log(kamu/(1 − kamu)) versus log(pO2)]. (B) Model MWC. Tetramer hemoglobin diasumsikan berada dalam salah satu dari dua konformasi simetris: keadaan T dengan afinitas rendah (K T) atau status R dengan afinitas tinggi (K R). Dalam setiap konformasi ada lima keadaan yang ditandai dengan jumlah oksigen yang terikat (0–4). Konstanta kesetimbangan antara keadaan terdeoksigenasi penuh adalah L 0 (≫ 1) dan antara keadaan teroksigenasi penuh adalah L 4 (≪ 1). Pada tingkat oksigen rendah, molekul berada dalam keadaan T. Pada tingkat oksigen yang tinggi, kesetimbangan bergeser ke arah keadaan R karena pengikatan oksigen meningkat. L T0R4 adalah konstanta kesetimbangan dalam kondisi standar antara keadaan T0 dan R4. (C) Diagram energi untuk model MWC. Arti fisis dari konstanta kesetimbangan L dan afinitas K dapat dipahami dari plot ini yang menggambarkan tingkat energi dalam kondisi standar. Untuk diskusi detail lihat Teks SI . (D) Kurva saturasi terukur dan MWC cocok untuk beberapa organisme (kotak) dan beberapa kondisi fisiologis (lingkaran). Untuk penggambaran di ruang Bukit lihat SI Gambar 6.

Kurva saturasi dipengaruhi oleh kondisi fisiologis yang berbeda. Berbagai efektor, seperti difosfogliserat [DPG (19), diproduksi sebagai produk sampingan metabolisme selama permintaan oksigen tinggi] dan pH yang diturunkan (diproduksi sebagai produk sampingan metabolisme anaerobik di otot) mempengaruhi kurva saturasi. Ketika suatu organisme berubah dari istirahat ke aktivitas berat, kebutuhan oksigennya yang meningkat menyebabkan pH dalam jaringan turun, menggerakkan kurva saturasi ke kanan (p lebih tinggi50) [efek Bohr (20, 21)]. Adaptasi fisiologis ini (beroperasi dalam skala menit hingga jam) dapat dibandingkan dengan adaptasi evolusioner (beroperasi dalam skala ribuan tahun), menanggapi perubahan ketinggian, gaya hidup, aktivitas fisik, ukuran tubuh, atau modifikasi perkembangan plasenta, yang mempengaruhi keseimbangan transportasi oksigen ibu-janin.


Abstrak Grafis

Highlight

The nH nilai untuk transisi konformasi memerlukan status referensi. Untuk transisi konformasi dengan nH > 1, untuk monomer yang setara: nH < 1. Rasio oligomer dan monomer yang sebenarnya nH nilainya sama dengan jumlah monomer. Normalisasi meregangkan kurva dosis-respons dan meningkatkan nilai nH. Konsep monomer setara pertama kali diusulkan pada tahun 1965 oleh Crick dan Wyman.


Pengertian Fungsi Saturasi dalam Model Monod-Wyman-Changeux - Biologi

Ketika mioglobin, sebagai protein pengikat oksigen monomer, mungkin terbatas pada saturasi hiperbolik, oksigen berikatan secara kooperatif dengan hemoglobin. Hal ini menimbulkan bentuk sigmoidal ke kurva saturasi oksigen untuk hemoglobin.

Model sederhana dan elegan untuk kurva pengikatan sigmoidal adalah simetri atau Model Monod-Wyman-Changeux (MWC). Dalam model ini, hemoglobin mengadopsi dua bentuk fungsional berbeda yang memiliki afinitas berbeda terhadap oksigen. Perbedaan fungsional kuantitatif ini mungkin terkait dengan perbedaan struktural, atau konformasi tertentu, dan interkonversi antara ini dapat (pada prinsip umum) menyebabkan perubahan dalam struktur sekunder, tersier, dan kuaterner. Dalam model MWC umum, ditetapkan bahwa konformasi afinitas yang lebih rendah untuk protein pengikat ligan multimer (dilambangkan status T) dapat mengalami perubahan ke status afinitas yang lebih tinggi (dilambangkan status R), dan sebaliknya. Dengan kata lain, bentuk R dan T dapat dengan cepat mencapai kesetimbangan. Dalam hal ini, peningkatan konsentrasi ligan akan mendorong keseimbangan antara R dan T menuju keadaan R, hubungan antara ikatan ligan dan keseimbangan interkonversi R dan T disebut kerjasama positif. Kami menyebut efek konsentrasi ligan pada keseimbangan konformasi antara R dan T a efek homotropik. Model dapat mengakomodasi molekul efektor lain yang mengikat di situs yang berbeda dari situs pengikatan ligan dan dengan demikian mempengaruhi keseimbangan R dan T di kedua arah. Ini disebut efek heterotropik.

Untuk hemoglobin, detail molekuler dari peralihan antara R dan T ini dibahas dalam teks luar. Efek Bohr heterotropik meningkatkan transportasi oksigen dari paru-paru ke jaringan pernapasan, serta transportasi karbon dioksida dalam arah yang berlawanan. Efektor heterotropik lainnya adalah molekul kecil 2,3-bifosfogliserat (BPG), yang berikatan dengan deoksihemoglobin, menggeser kesetimbangan konformasi menuju keadaan T. BPG berperan dalam adaptasi ketinggian. Hemoglobin janin memiliki afinitas yang lebih rendah untuk BPG sehingga hemoglobin janin memiliki proporsi yang lebih tinggi dari konformer keadaan R daripada hemoglobin dewasa pada setiap tekanan oksigen dan oleh karena itu afinitas yang agak lebih besar untuk oksigen. Hemoglobin adalah model untuk apa yang disebut protein alosterik, protein yang menunjukkan perilaku kooperatif seperti itu, melalui efek homotropik dan heterotropik. Model teoretis untuk allosterisme adalah model MWC/simetri yang disebutkan di atas. dan tidak simetris model berurutan. Varian hemoglobin merupakan faktor dalam patologi manusia. Kami mempertimbangkan kasus anemia sel sabit.

Hemoglobin dan perilaku alosterik dalam protein

Studi tentang hemoglobin (Hb) memberikan beberapa pandangan yang paling menarik tentang bagaimana hubungan struktur-fungsi protein menjelaskan adaptasi fisiologis. Kami merasa berguna untuk mempertimbangkan protein pengikat ligan multimerik seperti Hb sebagai kontras dengan protein pengikat ligan monomer (dalam hal ini mioglobin atau "Mb") dan untuk mengembangkan model dasar untuk kooperatifitas dan regulasi alosterik. Setelah ini, kami akan mengalihkan perhatian kami ke detail struktural dan kimia di balik kemampuan Hb untuk menjadi pengangkut oksigen yang begitu efektif.

Sifat dan peran fisiologis protein yang terdiri dari lebih dari satu subunit dapat berbeda secara signifikan dari versi monomer protein homolog fungsional. (Dengan subunit, yang kami maksud adalah rantai polipeptida terpisah). Contoh kasus adalah kontras antara hemoglobin tetramerik (terdiri dari empat subunit) dan mitra monomernya mioglobin di otot.

Pengikatan beberapa ligan di beberapa situs protein dapat menyebabkan perilaku yang sangat kompleks. Alosterik adalah istilah yang diterapkan pada fenomena di mana ligan yang mengikat pada situs yang jauh dari satu sama lain dalam struktur protein berinteraksi secara fungsional.

Hasil paling umum dari interaksi fungsional antara subunit ini adalah kerjasama. Sifat oligomer hemoglobin (Hb), misalnya, memungkinkan terjadinya efek kooperatif antar subunit, di mana pengikatan ligan ke situs pengikatan ligan tertentu pada satu subunit mempengaruhi afinitas subunit yang lain untuk ligan yang sama. Ini disebut homotropik memengaruhi. Dalam Hb, interaksi homotropik antara tempat pengikatan oksigen memiliki sifat bahwa pengikatan satu molekul oksigen di satu tempat meningkatkan afinitas tempat lain untuk oksigen - yaitu, pengikatan ligan di Hb menunjukkan kerjasama positif. Efek alosterik juga bisa heterotropik, melibatkan interaksi antara ligan yang berbeda. Efek alosterik heterotropik juga terjadi pada hemoglobin. Ligan seperti CO2, H + , dan 2,3-BPG mempengaruhi afinitas situs pengikatan di Hb untuk O2.

Kurva pengikatan non-kooperatif & amp kooperatif

Seperti yang telah kita lihat untuk mioglobin, persamaan prediksi untuk pecahan kamu dari situs pengikatan ligan yang ditempati dalam kasus situs pengikatan ligan independen (misalnya ketika situs berada pada molekul terpisah) menggambarkan kurva pengikatan hiperbolik. Yaitu ketika kamu diplot sebagai fungsi konsentrasi ligan, nilai kamu pada awalnya sangat meningkat dengan ligan yang ditambahkan relatif sedikit, tetapi karena konsentrasi ligan meningkat, peningkatan kamu dengan jumlah yang sama dari ligan yang ditambahkan turun terus. Akhirnya, batas asimtotik kamu = 1 didekati. Nilai dari KD mewakili konsentrasi ligan di mana setengah situs yang tersedia ditempati, yaitu kamu = 0,5. Kurva hiperbolik yang dijelaskan oleh persamaan berikut mewakili kasus pengikatan non-kooperatif.

Grafik di bawah ini menunjukkan kurva pengikatan kooperatif, dan berbeda dengan kurva pengikatan non-kooperatif, ia memiliki bentuk sigmoidal. Inilah yang diamati untuk kurva pengikatan oksigen hemoglobin. Hemoglobin menunjukkan kooperatifitas positif karena pengikatan ligan pertama meningkatkan afinitas untuk ligan berikutnya, dan seterusnya. Kurva sigmoidal seperti itu adalah karakteristik transisi kooperatif antara dua keadaan berbeda yang melibatkan pembuatan (atau gangguan) banyak interaksi lemah (non-kovalen).

Kurva pengikatan non-kooperatif adalah untuk KD = 1. Kurva kooperatif dihitung berdasarkan model simetri (lihat VVP4e, hal.192 juga dikenal sebagai bersatu atau MWC model, dengan nama terakhir berasal dari nama pencetusnya, Monod, Wyman, dan Changeux). Model ini dijelaskan lebih lanjut di bawah ini.

Model MWC atau "bersatu" untuk kooperatifitas dan regulasi alosterik

Sebuah model yang mendalilkan perubahan terpadu dari satu struktur kuartener yang sepenuhnya simetris menjadi yang lain sebagian besar dapat menjelaskan sifat khas hemoglobin. Model elegan ini, yang akan kita sebut MWC model, menyumbang kooperativitas positif homotropik, serta efek alosterik heterotropik. Model MWC dinamai Jacques Monod, Jeffries Wyman, dan Pierre Changeux, yang merumuskan model mereka untuk alosterik pada tahun 1965. Jacques Monod adalah salah satu pelopor besar biologi molekuler.

Konsep dua keadaan simetris yang berbeda adalah postulat sentral dari model MWC. Untuk hemoglobin, telah melihat bukti struktural untuk setidaknya dua struktur kuaterner yang berbeda, sesuai dengan deoksi-Hb dan oksi-Hb, dan kedua struktur ini berfungsi sebagai prototipe untuk apa yang dapat kita sebut status T dan R, dua kuaterner simetris penuh. struktur, dengan afinitas yang berbeda untuk ligan (atau substrat). Di bawah ini, penggunaan konsep kesetimbangan untuk sampai pada persamaan yang mereproduksi kurva pengikatan ligan yang kooperatif positif dibahas.

Gambar di bawah mengilustrasikan model MWC untuk protein pengikat ligan tetramerik hipotetis, dengan ligan dilambangkan sebagai A. Subunit tetramer direpresentasikan sebagai kotak atau lingkaran, yang mewakili dua status yang dapat diadopsi oleh subunit, T (afinitas rendah untuk A - kotak) dan R (afinitas tinggi, lingkaran). Setiap molekul protein, baik T atau R, dapat mengikat 0, 1, 2, 3, atau 4 ligan, menghasilkan semua kesetimbangan yang ditunjukkan.

Perhatikan bahwa modelnya sepenuhnya simetris: tidak ada keadaan antara (pencampuran kotak dan lingkaran). Keadaan kuarter T terdiri dari empat subunit (ditampilkan sebagai kotak) semuanya dengan struktur tersier afinitas rendah (kita dapat memberi label setiap kotak dalam kelompok empat sebagai "T”) dengan masing-masing situs pengikatan ligan memiliki yang relatif lebih besar KD nilai. Keadaan kuartener R terdiri dari empat subunit (ditunjukkan sebagai lingkaran) semua dengan struktur tersier afinitas tinggi (kita dapat memberi label setiap lingkaran dalam kelompok empat sebagai "R”) dengan masing-masing situs pengikatan ligan memiliki yang relatif lebih kecil KD nilai. Panjang panah yang mewakili kesetimbangan pengikatan sepanjang arah horizontal gambar secara kualitatif menunjukkan perbedaan afinitas ini: baris atas kesetimbangan pengikatan keadaan T dibandingkan dengan baris bawah kesetimbangan keadaan R menunjukkan bahwa ligan mengikat secara istimewa ke situs pada molekul keadaan R. Panjang relatif panah tetap sama di kedua baris sepanjang jalan. Sebaliknya, panah vertikal yang mewakili keseimbangan antara R dan T menunjukkan secara kualitatif melalui perubahan panjangnya bahwa ketika konsentrasi ligan meningkat, dan protein menjadi semakin jenuh dengan ligan, keseimbangan R & hArr T semakin mendukung keadaan R. Model ini menghasilkan kurva saturasi sigmoidal (kamu vs. [A]).

Dalam deskripsi matematis ini, model menggunakan tiga parameter: n, yang merupakan jumlah situs pengikatan ligan per molekul (biasanya sama dengan jumlah subunit) L, yang didefinisikan sebagai konstanta kesetimbangan untuk konversi keadaan R ke keadaan T dan C, rasio KD untuk keadaan R menjadi KD untuk keadaan T.

Salah satu fitur yang sangat memuaskan dari model ini adalah - dalam kasus hemoglobin (n = 4) - kita dapat menjelaskan efek homotropik dan heterotropik dalam parameter tunggal L. Secara khusus, kooperatifitas positif dijelaskan (karena hubungan antara pengikatan dan kesetimbangan konformasi) sebagai penurunan L dengan meningkatnya konsentrasi ligan. Efek heterotropik, seperti pengikatan BPG dan efek Bohr, dijelaskan oleh peningkatan L yang diinduksi oleh pengikatan BPG atau H +. Dalam grafik yang ditunjukkan di sini, yang merupakan plot persamaan untuk kamu diberikan di atas, kedua kurva menunjukkan efek perubahan L ketika n = 4 dan C dijaga tetap pada nilai 0,014. Peningkatan L mendukung keadaan T dan menggeser kurva sigmoidal ke kanan.


Menuju pemodelan kinetik jaringan metabolisme skala genom tanpa mengorbankan kendala stoikiometrik, termodinamika dan fisiologis

Pemodelan matematika adalah alat penting untuk pemahaman yang komprehensif tentang metabolisme sel dan interaksinya dengan kondisi lingkungan dan proses. Perkembangan terbaru dalam konstruksi dan analisis model stoikiometrik memungkinkan untuk menentukan batas pada perilaku metabolisme kondisi mapan menggunakan analisis keseimbangan fluks. Namun, informasi rinci tentang kinetika enzim dan regulasi enzim diperlukan untuk merumuskan model kinetik yang dapat secara akurat menangkap respons metabolisme dinamis. Penggunaan kinetika enzim mekanistik adalah tugas yang sulit karena ketidakpastian dalam sifat kinetik enzim. Oleh karena itu, sebagian besar karya terbaru hanya mempertimbangkan kinetika aksi massa untuk reaksi dalam jaringan metabolisme. Di sini, kami menerapkan kerangka kerja pengoptimalan dan analisis risiko entitas hidup kompleks (ORACLE) dan membangun model kinetika mekanistik skala besar dari Escherichia coli yang tumbuh secara optimal. Kami menyelidiki interaksi kompleks antara stoikiometri, termodinamika, dan kinetika dalam menentukan fleksibilitas dan kemampuan metabolisme. Hasil kami menunjukkan bahwa saturasi enzim merupakan pertimbangan yang diperlukan dalam pemodelan jaringan metabolisme dan memperluas rentang fluks metabolisme dan konsentrasi metabolit yang layak. Hasil kami lebih lanjut menunjukkan bahwa enzim dalam jaringan metabolisme telah berevolusi untuk berfungsi pada keadaan saturasi yang berbeda untuk memastikan fleksibilitas dan ketahanan metabolisme seluler yang lebih besar.

Kata kunci: Elastisitas Aksi massa Saturasi Stabilitas Termodinamika.


Pengantar

Hemoglobin adalah protein alosterik model klasik, dengan penelitian tentang protein ini mencerminkan pengembangan kooperatif kunci dan konsep alosterik [1-7]. Profil sigmoidal stabil dari pengikatan oksigen ke hemoglobin memberikan dasar untuk formulasi Hill 'all-or-none' yang ditawarkan pada tahun 1910 [8]. Lima belas tahun kemudian, Adair mengusulkan mekanisme pengikatan bertahap fenomenologis untuk menjelaskan saturasi hemoglobin [9]. Makalah seminal oleh Linus Pauling yang diterbitkan sepuluh tahun kemudian adalah yang pertama menyarankan penjelasan struktural atau berorientasi geometri untuk pengikatan oksigen kooperatif oleh hemoglobin. Pauling membangun fungsi partisi besar agar sesuai dengan data Adair menggunakan model sekuensial sederhana dengan konstanta pengikatan oksigen tunggal dan parameter interaksi heme-heme tunggal [10]. Upaya selanjutnya untuk merasionalisasi ikatan kooperatif oksigen ke hemoglobin mengandalkan model mekanistik Monod-Wymann-Changuèx (MWC) [11-12] dan model mekanistik Koshland-Nemethy-Filmer (KNF) yang diilhami Pauling, keduanya dikembangkan di pertengahan 1960-an dan masing-masing melibatkan transisi subunit bersama dan berurutan. Selanjutnya menjadi jelas bahwa model MWC (Gambar S1 (panel A)) lebih baik menggambarkan fungsi hemoglobin. Secara khusus, hemoglobin ditemukan berada dalam keseimbangan antara konformasi deoksi dan oksi, sesuai dengan korelasi struktural masing-masing. T dan R konformasi kuaterner dari formulasi MWC [14-16]. Kedua, baik konformasi, ketika diisolasi dalam kristal [17-18] atau fase gel [19-20], mengikat empat molekul oksigen secara independen (hiperbolik), meskipun dengan afinitas yang berbeda (KT dan KR, masing-masing). Bukti lain, dirangkum dalam berbagai ulasan (e.G. [6, 21]), menunjukkan bahwa model MWC cukup menjelaskan interaksi homotropik dalam hemoglobin yang melibatkan empat O . jauh2-mengikat situs.

Namun, gambaran yang berbeda muncul ketika mencoba menerapkan model MWC dalam menjelaskan interaksi heterotropik hemoglobin. Menurut model MWC, ligan alosterik, apakah mengaktifkan atau menghambat, hanya mempengaruhi T ke R kesetimbangan konformasi kuaterner protein (L = [T]/[R]) [11-12]. Memang, Edelstein (1971) menunjukkan bahwa efek basa Bohr hemoglobin dengan fenomena 'buffering of cooperativity' yang terkait (yaitu, pengamatan bahwa perubahan pH terutama mempengaruhi afinitas oksigen (P50) tanpa perubahan kooperatifitas (nH) lihat S1 Gambar (panel B)) dapat dijelaskan oleh perubahan yang diinduksi proton dalam L [22]. Namun, upaya untuk menyesuaikan kurva saturasi keadaan tunak hemoglobin dengan adanya H + , CO2 atau inhibitor organofosfat ke persamaan MWC, dengan asumsi L-hanya efek, secara konsisten gagal. Sebaliknya, kecocokan yang berhasil dengan data fisiologis semacam itu diperoleh hanya ketika keduanya L dan C (= KR/KT) parameter diizinkan untuk berubah [23-27]. Pengamatan kondisi mapan ini menyerukan modifikasi model MWC asli untuk memasukkan status konformasi kuaterner tambahan untuk hemoglobin [24, 28] atau interaksi tersier [29-31]. Hemoglobin tidak lagi dianggap sebagai protein MWC 'murni' (lihat Diskusi). Namun, beberapa poin mengenai prosedur pemasangan kurva tetap bermasalah. Pertama, bilah kesalahan besar biasanya diperoleh untuk parameter yang dievaluasi, terutama untuk L [23], menunjukkan bahwa data, bahkan jika sampel akurat dan intensif, tidak membatasi nilai parameter dan bahwa set parameter lain juga dapat menghasilkan kecocokan yang sukses. Kedua, nilai yang diperoleh untuk L dan C parameter dari dataset fisiologis yang berhubungan dengan konsentrasi sering berkorelasi tanpa penjelasan mekanistik intuitif [29,31-32]. Akhirnya, dalam banyak kasus, turunan L atau C nilai gagal untuk skala dengan konsentrasi efektor, bukannya tampak berkorelasi artifisial (lihat, misalnya, dataset fisiologis ketat disajikan dan dianalisis dalam S2 Gambar, mengatasi efek Bohr hemoglobin dengan adanya inhibitor organofosfat yang berbeda [29]). Pengamatan ini mendorong saran bahwa data saturasi hemoglobin dapat dijelaskan hanya dengan dua [31], dan kemudian, bahkan oleh satu [32] parameter MWC. Dapat dikatakan bahwa poin-poin ini berkontribusi pada gagasan umum bahwa perkiraan untuk parameter MWC, khususnya L, tidak selalu dapat diandalkan dan harus dilihat dengan hati-hati.

Studi meta-analisis yang elegan tentang fungsi hemoglobin oleh Milo dkk. [33] membahas masalah ini dengan cara yang ketat. Studi ini mengungkapkan bahwa karena sensitivitas yang berbeda dari L, KR dan KT parameter untuk variasi eksperimental, nilai untuk parameter ini tidak dapat ditentukan dengan pasti menggunakan persamaan MWC tradisional (lihat Gambar 3 dalam referensi [33]). Untuk mengatasi kekurangan ini, penulis menyajikan bentuk persamaan MWC yang dimodifikasi, diparameterisasi ulang berdasarkan Lc 4 dan LKR 4 parameter senyawa. Memasang data pengikatan oksigen keadaan tunak ke persamaan yang dimodifikasi menghasilkan perkiraan yang andal untuk LKR 4 dan Lc 4 parameter hemoglobin [33]. Menimbang bahwa parameter ini masing-masing terkait dengan titik transisi titik tengah (P50) dan kerjasama (nH) parameter fenotipik dari kurva pengikatan [33], penggunaan versi modifikasi persamaan MWC masuk akal secara intuitif. Namun, persamaan yang dimodifikasi tidak dapat memberikan perkiraan untuk elemen dasar L, KR dan KT Parameter MWC hemoglobin.

NS L, KR dan KT parameter terkait dengan langkah-langkah konkret dan mudah diinterpretasikan dalam jalur ligasi MWC [11]. Selain itu, mengetahui nilai parameter ini sangat penting untuk memahami bagaimana perubahan fisiologis, mutasi, dan variasi evolusioner memengaruhi fungsi hemoglobin. Dalam naskah ini, kami menyajikan dua strategi sederhana untuk mendapatkan perkiraan yang andal dari L, KR dan KT untuk variasi fisiologis dan evolusioner dan menawarkan kriteria untuk menilai kinerja setiap strategi. Dengan menggunakan dataset fungsional fisiologis dan evolusioner ekstensif yang tersedia untuk protein alosterik model hemoglobin yang disusun sebelumnya [33], kami mendemonstrasikan kegunaan strategi yang dijelaskan di sini untuk memperoleh pengetahuan mekanistik yang andal tentang hemoglobin. Hasil kami menunjukkan bahwa interaksi homotropik dan heterotropik dijelaskan secara memadai oleh model MWC tradisional. Selanjutnya, penelitian ini menggambarkan peta jalan umum untuk pemasangan yang berhasil dari data pengikatan ligan kondisi mapan ke model alosterik MWC untuk menghasilkan perkiraan yang andal untuk parameter mekanistik protein yang diminati.


Hasil dan Diskusi

Model Ikatan Ligan dan Perubahan Konformasi.

Gambar 1 menunjukkan model MWC klasik untuk ligan (A) yang mengikat protein yang dapat eksis baik dalam keadaan R atau T (11). Dalam kasus ATCase, pengikatan mungkin ke situs c (substrat) atau r (efektor), dan enam substrat/efektor dapat mengikat setiap molekul (yaitu, n = 6). Karena masing-masing dari enam rantai c (atau rantai r) diasumsikan setara dalam model ini, semua konstanta disosiasi mikroskopis untuk keadaan tertentu adalah sama (KD, R Mikro dan KD, T Mikro untuk keadaan R dan T, masing-masing) dan KD(T, j) = J/(nJ + 1)KD, T mikro. Kesetimbangan pengikatan terkait pada Gambar 1 membentuk siklus termodinamika sehingga L′ = c n L, di mana L = [Tn]/[Rn], L′ = [Tn·An]/[Rn·An], dan C = KD(R, j)/KD(T, j) = KD, R mikro /KD, T mikro. Karena kesederhanaan inherennya, model MWC telah digunakan untuk menjelaskan pengikatan ligan dalam banyak sistem kooperatif (11), dan dalam kasus ATCase, sejumlah besar bukti akumulasi selama periode ekstensif mendukung mode pengikatan ini (9). Pada prinsipnya, spektroskopi NMR adalah alat yang sangat kuat untuk menguji model lebih lanjut dan untuk mendapatkan jawaban pasti yang kurang didapat dari teknik lain. Misalnya, dengan pendekatan biofisik lainnya yang tidak menyelidiki situs tertentu secara independen tetapi hanya melaporkan sifat rata-rata, efek lokal yang disebabkan oleh pengikatan substrat/efektor tidak dapat dipisahkan dari pergeseran global yang menyertainya dalam keseimbangan R–T. Sebaliknya, kami menunjukkan di bawah ini bahwa perubahan dalam pergeseran kimia di sekitar situs pengikatan sebagai respons terhadap pengikatan ligan memberikan reporter sensitif tentang keseimbangan pengikatan protein ligan, sedangkan munculnya resonansi terpisah yang sesuai dengan keadaan R dan T secara bersamaan mengarah pada kesimpulan yang pasti. tentang efek pengikatan ligan pada kesetimbangan R–T. Kemampuan untuk 𠇍issect” keseimbangan kompleks Gambar 1 telah dimanfaatkan, misalnya, untuk menetapkan secara meyakinkan bahwa pengikatan nukleotida menggeser rasio R–T, titik yang tetap kontroversial (13, 14).

Metil-TROSY dari ATCase.

Gambar 2 menunjukkan spektrum korelasi kuantum ganda heteronuklear (HMQC) methyl-TROSY 1 H-13 C dari U-[ 2 H]Ile-[㭁 13 CH3]-berlabel unliganded WT-ATCase direkam pada 800 MHz (frekuensi 1 H) dalam 40 menit pada spektrometer yang dilengkapi dengan kepala probe suhu kamar pada 37ଌ (0,1 mM dalam kompleks, 0,6 mM dalam monomer). Rasio signal-to-noise yang tinggi dari kumpulan data dan waktu pengukuran yang singkat yang diperlukan menunjukkan bahwa gugus metil akan menjadi probe yang berharga dari konformasi dan dinamika molekuler dalam sistem ini, memungkinkan efek dari berbagai ligan untuk dipelajari dalam waktu yang relatif singkat. memesan. Selanjutnya, karena molekul holoenzim dapat dirakit dari rantai r dan c (dengan pola pelabelan NMR yang berbeda jika diinginkan) (19), dimungkinkan untuk segera menetapkan korelasi untuk jenis rantai dan, jika perlu, untuk mempelajari enzim utuh yang diberi label hanya salah satu dari dua rantai. Seperti yang diilustrasikan Gambar. 2, wilayah Ile dari peta korelasi 1 H, 13 C dari ATCase diselesaikan dengan baik, dan dengan menyiapkan sampel dengan label terbatas pada rantai r atau c, dimungkinkan untuk memisahkan dua atau tiga silang yang tumpang tindih. puncak dan menghitung semua 27 korelasi yang berasal dari 27 residu Ile dalam molekul. Karena tidak adanya ligan, keseimbangan R–T bergeser tinggi ke T (9), spektrum Gambar 2 dengan demikian sesuai dengan keadaan T. Selanjutnya, karena hanya satu korelasi yang diamati untuk setiap Ile, setiap rantai c (r) harus identik secara struktural atau, sebagai alternatif, setiap perbedaan struktur antara rantai harus dirata-ratakan dengan cepat pada skala waktu pergeseran kimia NMR (yaitu, pertukaran cepat ). Although it likely is possible that individual peaks could be assigned to specific sites in the protein by using approaches similar to those described in the context of our work on the proteasome (5), we have not done so here. Instead, we show that quantitative inferences about binding and allostery can be made simply by analysis of how spectra change as a function of ligand, without time-consuming steps that are involved in resonance assignment.

Binding of Active Site Ligands and Analogues.

Upon titration of U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3]-labeled WT-ATCase with substrate CbmP or its nonhydrolyzable analogue phosphonoacetamide (PAM), a number of the correlations derived from the c chain shift linearly, consistent with weak binding (millimolar affinity) and exchange rates that are fast on the NMR chemical shift time scale [see below and supporting information (SI) Fig. 6]. In contrast, cross-peaks from residues in the r chain (that are all distant from the binding site) do not shift during the titration. During the course of the titration, a second set of correlations emerges, consistent with a second conformation in slow exchange with the T state. This finding is illustrated in Fig. 3 A, which focuses on an Ile correlation from the r chain with chemical shifts (ω 13 C,ω 1 H) = (9.3 ppm, 0.90 ppm) in the unliganded WT state ( Fig. 3 A Upper, first column) and a second Ile correlation (9.8 ppm, 0.31 ppm) derived from the c chain ( Fig. 3 A Lower). Addition of saturating amounts of CbmP or PAM produces a second set of peaks for both correlations, as indicated in the second and third columns of Fig. 3 A. To establish the identity of this second state, we have recorded spectra of ATCase with different substrates or analogues that are known to shift the equilibrium to R and of a double mutant (cK164E, cE239K) that has been shown to be exclusively in the R form even when unliganded (22). Columns 4 and 5 of Fig. 3 A show how spectra change with saturating amounts of the high-affinity, bisubstrate analogue phosphonoacetyl- l -aspartate (PALA) ([PALA]/[ATCase]monomer = 1.5, where [ATCase]monomer is the concentration of the c chains that form the PALA binding site) and saturating quantities of CbmP and succinate, an analogue of the reactant aspartate ([CbmP]/[ATCase]monomer = 30, [succinate]/[ATCase]monomer = 75), respectively. The corresponding region of the Ile correlation map of unliganded cK164E, cE239K𠄺TCase is shown in column 6. The excellent correspondence between chemical shifts of the second conformer in spectra of CbmP or PAM-loaded WT-ATCase and the correlations in the subspectra of columns 4𠄶 that are known to derive from the R state establishes that the observed second state in CbmP- or PAM-saturated ATCase is indeed the R form of the enzyme. Note that the correspondence in shifts is better for residues in the r chain ( Fig. 3 A Upper) than in the c chain ( Fig. 3 A Lower) because residues proximal to substrate binding sites formed by the c chains sense both the binding event and the T to R conformational transition. Further, the similarity in shifts between spectra of unliganded cK164E, cE239K𠄺TCase and R states of the enzyme generated through the addition of ligands argues strongly that the double mutant form of the enzyme is a good model of the R state (see SI Fig. 7). The titration data also establish unequivocally that both CbmP and PAM shift the equilibrium toward R and thus bind preferentially to this state, in agreement with the MWC model. This finding is in contrast to results from earlier literature in which it was argued that CbmP binding would not shift the equilibrium (23). Finally, the absence of exchange cross-peaks connecting correlations between R and T states in magnetization exchange experiments recorded on a PAM-saturated sample allows an upper limit of 𢒁/s to be placed on the exchange between the two conformers.

Because the exchange between R and T conformers is slow on the NMR chemical-shift time scale (i.e., separate correlations are observed for each state), it is possible to measure the R–T equilibrium under saturating conditions of PAM or CbmP (see below), where correlations derived from both states are visible. In the absence of chemical-shift assignments of correlations in R and T states, care must be taken to ensure that equilibrium constants are derived from intensities of cross-peaks that belong to the same residue. Two residues have been identified for which the R–T pairs can be assigned with certainty, corresponding to the correlations illustrated in Fig. 3 A (SI Fig. 8), and values of L′ can be estimated from them. Differential relaxation of magnetization from R and T states during the course of the NMR experiment that could perturb the relative intensities of correlations, and hence L′ values, also must be accounted for, as described in Bahan dan metode. A value of L′ = 3.4 ± 1.2 has been calculated with PAM saturation, corresponding to ΔGT−R = 𢄠.76 ± 0.22 kcal/mol. Because of the lability of CbmP, only an approximate value of L′ = 1.5 (ΔGT−R ∼ 𢄠.24 kcal/mol) could be obtained for this compound. Values of L′ for CbmP and PAM are in reasonable agreement with the previously reported value of 7 for CbmP, considering that different pH values were used in the two sets of measurements (1 pH unit different) (10), the known sensitivity of ATCase function to pH (24), the different solvents used (H2O versus D2O), and the fact that ATCase used in the present set of experiments is highly deuterated.

Measuring the R–T Equilibrium Constant.

The ability to monitor R and T conformations independently provides NMR with a unique advantage over many other spectroscopic techniques. It can be shown that if ligand binding is in the fast exchange limit and separate signals are observed from the R and T states (i.e., slow exchange), then chemical shift changes of cross-peaks belonging to either R or T states that accompany ligand binding can be described by a simple hyperbolic isotherm with the extracted dissociation constant KD, R Micro or KD, T Micro (see Teks SI). In contrast, titration curves derived from techniques that monitor contributions from both R and T states simultaneously must be analyzed by taking the complete reaction scheme into account ( Fig. 1 ), and the resulting binding curves will be sigmoidal. Gambar 3 B shows the titration of a correlation from WT-ATCase (Kiri) as a function of added PAM along with the corresponding titration for the same residue from cK164E, cE239K𠄺TCase (Benar). All titration curves that derive from binding to either T (WT-ATCase) or R (cK164E, cE239K𠄺TCase Fig. 3 C) states of the enzyme were fit simultaneously to a simple PAP + A model. Excellent fits were obtained with this hyperbolic binding model, as expected. Nilai dari KD, T Micro = 3.8 ± 0.3 mM and KD, R Micro = 1.8 ± 0.1 mM were extracted from fits of 8 and 10 titration curves, respectively, and by using these KD Micro values along with L′ = 3.4 ± 1.2 and the relation L′ = C 6 L (see above), a value of 300 ± 190 is calculated for L = [T6]/[R6] ( Fig. 1 ), corresponding to ΔGT−R = 𢄣.5 ± 0.4 kcal/mol, which agrees well with a previously published value of L = 250 based on analytical ultracentrifugation (10) and less well with L = 70 obtained from SAXS (25). Thus, even though correlations from the R state cannot be observed in spectra of unliganded WT-ATCase, the relative populations of R and T still can be established, albeit indirectly, by using the linked binding equilibria of Fig. 1 and data obtained from titration of R and T states with ligand.

Effects of Ligand Binding to the Regulatory Chains.

The presence of significant populations of both R and T conformers in the PAM-saturated enzyme ( Fig. 3 A) allows a straightforward determination of how effectors such as ATP and CTP perturb the R–T equilibrium. Gambar 4 A shows examples of how the R–T equilibrium is shifted upon addition of MgATP (Tengah) or MgCTP (Benar) starting from PAM-loaded WT-ATCase (Kiri). Although it is difficult to quantify precisely the shift upon addition of ATP, because the population of the T state becomes very low, changes in L′ of 15- to 30-fold are estimated from spectra, leading to a decrease in L′ from 3.4 ± 1.2 to 0.1𠄰.2. Conversely, the effect with CTP is opposite, with correlations from the R conformer disappearing completely from spectra. Such changes are in complete agreement with the MWC model of heterotropic effects, where binding of ATP to the R state is favored and binding of CTP to the T state is preferred.

The spectra of Fig. 4 A, which were obtained with saturating amounts of PAM, could also be explained, however, under the assumption that MgATP binding does not affect the R–T equilibrium directly but rather promotes conformational changes in at least one of the states. These changes would lead to an increase in R state affinity for substrate Asp (12) or for its analogue succinate and by extension also for the CbmP analogue, PAM, and subsequent shifting of the R–T equilibrium only on substrate binding. The latter explanation was put forth to explain the results of SAXS experiments (13, 26). In particular, if this model were operative, we would expect to see significant changes in chemical shifts of probes in the c chain upon ATP binding that reflect the “postulated” changes in structure leading to higher affinity of substrate, which, however, is not what we observed. Of the 22 cross-peaks in 1 H, 13 C correlation spectra of U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3] PAM-saturated WT-ATCase that are well resolved (belonging to either of T or R conformers), only 2 change position by at least 0.1 ppm in 1 H or 0.4 ppm in 13 C when MgATP is added. These two peaks, both from the regulatory chain, are almost certainly rIle12 and rIle86, which contact bound ATP directly (8). The other 20 peaks change positions by π.025 ppm and 0.2 ppm in 1 H and 13 C, respectively peaks obscured by overlap move very little as well. The fact that a set of 20 well dispersed peaks that includes probes in the c chain change position very little in response to the addition of MgATP suggests that even if binding of nucleotide does induce alteration of R and T conformations, these changes must be minor, at least in parts of the molecule remote from the site of nucleotide binding. A similar situation also holds for MgCTP. Results from a second experiment are even more conclusive in favor of the MWC model. From the measured value L = 300 for WT-ATCase and the fact that MgATP shifts the equilibrium to the R state by 15- to 30-fold (see above), L′ is predicted to be in the range of 10� in the presence of saturating amounts of ATP. Thus, the ATP-saturated R form of the enzyme is expected to constitute 𢒅�% of the population (effective monomer concentration of 50� μM), and with the sensitivity of the NMR methodology used here, such a fraction should be observable, even for a system as large as ATCase. As predicted by our numerical estimates and the MWC model, Fig. 4 B shows that the addition of saturating amounts of MgATP to unliganded WT-ATCase does indeed produce measurable amounts of R, estimated to be on the order of 5% on the basis of relative peak heights. Note that in the second set of spectra ( Fig. 4 B Lower), addition of ATP also causes a shift in one of the correlations from the T state (cross-peak tentatively assigned to rIle12), as indicated by the arrow. The only explanation for the appearance of R state cross-peaks is that MgATP is an allosteric effector that directly alters the R–T equilibrium.

To study the binding of MgATP to ATCase in more detail, we have recorded an ATP titration series. Unfortunately, the two significantly perturbed Ile correlations in 1 H- 13 C spectra, most likely derived from rIle12 and rIle86 as discussed above, are not particularly useful for quantifying binding because rIle12 titrates into another peak and rIle86 broadens very significantly in response to ATP addition (because of the large 1 H chemical-shift difference between free and bound forms, 0.64 ppm). To increase the number of probes available, a U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3],Leu,Val-[ 13 CH3, 12 CD3]-labeled WT-ATCase sample was prepared so that cross-peak positions from Leu and Val residues could be quantified as well. Labeling in the complex was confined to only the r chain, the site of ATP binding. The HMQC correlation map of this Ile-, Leu-, and Val-labeled ATCase sample is provided in SI Fig. 9 there are a total of 27 Leu and Val residues in the r chain, and 50 peaks can be counted in the Leu-Val region of the spectrum. Of interest, one of the Val residues, rVal121, is immediately adjacent to the fully protonated catalytic chain, and its signal would not be expected to be observed because of contributions to transverse relaxation resulting from proximal 1 H spins (27) such a situation also occurs for rIle115, which is proximal to the c chain.

Upon titration of MgATP into the Ile, Leu, and Val methyl-labeled sample of WT-ATCase, the majority of peaks shift in position, although no more than 36 Hz in either 1 H or 13 C dimensions, with little or no broadening, consistent with fast exchange. A pair of correlations that are assigned tentatively to Leu and Val residues from the amino-terminal end of the r chain that are proximal to the nucleotide binding site shift in position by at least 0.35 ppm in the 1 H dimension and broaden beyond detection during the course of the titration. Of note, the trajectories of at least six of the correlations that titrate in the fast exchange limit are not linear, indicating that the binding of MgATP to ATCase is more complex than 1:1, as observed previously (28, 29). To quantify the binding further, we chose 17 titration curves (either 1 H or 13 C) derived from 13 peaks that were in the fast exchange limit and fitted these data simultaneously to a number of binding models. Several of the titration profiles are shown in Fig. 5 A, dan Sisipan highlighting the response to binding for low [MgATP] makes it clear that the binding cannot be described by a hyperbolic function, which would characterize a 1:1 interaction. Global fits to such a model produced a poor reduced χ 2 value (𢒅) with noticeable deviations from experiment for low [MgATP]. The data subsequently were fit to a sequential binding model (SI Fig. 10) that assumes a pair of equivalent binding sites where the binding of ligand to the first site alters the affinity at the second (cooperative binding). Although outside the scope of the MWC model, which postulates that the intrinsic affinity of ligand at one site is independent of the binding of ligand to a second site (i.e., same microscopic binding), the sequential model is attractive on the basis of the structure of ATCase in which the regulatory chains that bind nucleotides are arranged as dimers that certainly could 𠇌ommunicate” in response to ligand binding (8).

Gambar 5 B shows a χ 2 surface of the distribution of K1 dan K2 values that are obtained from the fits of the titration curves, where K1 dan K2 are the macroscopic dissociation constants associated with the first and second binding events, respectively. The bold line, 4K1 = K2, indicates where microscopic dissociation constants for the first and second binding events are the same so that no binding cooperativity is observed. Points above the line correspond to positive cooperativity of binding (i.e., binding at the first site increases affinity at the second), whereas those below the line indicate negative cooperativity. The seven best solutions obtained from a grid search of (K1, K2) space are indicated by circles in the plot with the best solution corresponding to K1 = 7.9 mM and K2 = 0.25 mM. These solutions lie within a shallow trough on the χ 2 surface, where K1× K2 ∼ 2 mM 2 . Finally, the bold contour line encompasses the range of solutions that lie within the 95% confidence limit (for a model with 221 degrees of freedom). It is worth noting that an alternative model that assumes consecutive binding to two noninteracting sites with different affinities can be rejected via F test statistical criteria. Other studies involving NaATP binding in which data have been interpreted in terms of a consecutive binding model report K1 dan K2 values of 0.065 and 1.25 mM, respectively, at 4ଌ and K1 = 0.14 mM and K2 = 0.67 mM at 24ଌ, pH 7 (28, 29). Deviations from the values obtained here likely arise from the different experimental conditions used because, for example, it is known that increasing temperature decreases nucleotide affinity (28).

In summary, we have presented an NMR study of how ligand binding affects the allosteric equilibrium in the 306-kDa enzyme ATCase. Despite the size of this system, high-sensitivity 1 H, 13 C correlation maps of Ile, Leu, and Val methyl groups could be obtained in very reasonable measuring times (ρ h) using protein concentrations ρ mM in monomer (𼅠 μM in complex), so that large numbers of spectra could be recorded as a function of different ligands or ligand concentrations. By using relations that describe linked binding equilibria, a value for L = [T6]/[R6] could be calculated for WT ATCase, despite the fact that the R form of the protein is “invisible.” The effect of binding of a variety of different substrates or substrate analogues and nucleotides on the R–T equilibrium could be well understood within the framework of the MWC model, and the binding of MgATP to ATCase was shown unequivocally to alter this equilibrium, in contrast to observations from a series of other studies (12, 13, 25, 26). This work emphasizes the important role that modern solution NMR spectroscopy can play in providing quantitative information on systems with molecular masses in the hundreds of kilodaltons.


Informasi penulis

Afiliasi

Guangdong Provincial Education Department Key Laboratory of Nano-Immunoregulation Tumour Microenvironment, The Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, PR China

Centre for BioNano Interactions, School of Chemistry, University College Dublin, Dublin, Ireland

Kenneth A. Dawson & Yan Yan

School of Biomolecular and Biomedical Science, UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, University College Dublin, Dublin, Ireland