Informasi

Tautan antara lncRNA makro dan pengulangan DNA

Tautan antara lncRNA makro dan pengulangan DNA



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya bertanya-tanya apakah ada yang tahu beberapa publikasi tentang lncRNA makro (RNA yang sangat panjang tidak disambung) atau lebih umum RNA yang ditranskripsi yang dapat menyebabkan perulangan cis-DNA dari daerah genom yang tumpang tindih dengan transkrip lncRNA (makro)?

Terima kasih


Batu Kunci untuk ncRNA

Sebuah laporan tentang simposium Keystone 'Non-coding RNAs' yang diadakan di Snowbird, Utah, AS, 31 Maret hingga 5 April 2012.

Sekali waktu RNA cocok dengan dogma sentral sebagai pembawa pesan antara DNA dan protein. Selama 50 tahun terakhir, molekul RNA terus muncul sebagai pengatur genom yang dinamis dan serbaguna. Pemahaman modern kita tentang RNA non-coding (ncRNA) mungkin terlihat seperti kekacauan molekul yang saling terkait, tetapi secara kolektif mereka menunjukkan arsitektur dan koordinasi, yang mengarah pada regulasi DNA dan protein yang dikoreografikan secara elegan oleh RNA. Peran RNA yang muncul sebagai orkestra bergema di seluruh simposium Keystone perdana tentang ncRNA, dengan banyak contoh ncRNA panjang (lncRNA) memiliki peran penting di berbagai jalur biologis. Setelah pertemuan, jelas bahwa lebih banyak kejutan akan muncul dari 'materi gelap' genom.

Pidato utama oleh Nick Proudfoot (University of Oxford) mengatur panggung dengan menggambarkan bagaimana wilayah genom yang paling dipelajari secara klasik, seperti lokus -globin, sekarang muncul sebagai diatur dengan indah oleh RNA. Secara khusus, Proudfoot merangkum kerja bertahun-tahun yang menunjukkan bagaimana tindakan transkripsi melalui daerah non-coding, dan yang penting di mana penghentian transkripsi terjadi, mengatur dinamika epigenetik lokus. Menariknya, transkripsi konvergen oleh RNA polimerase II (RNA pol II) dapat berfungsi sebagai substrat untuk merekrut Dicer dan faktor lain dari mesin interferensi RNA (RNAi). Demikian pula, Robert Martienssen (Laboratorium Cold Spring Harbor) mempresentasikan interaksi antara aktivitas RNA / DNA polimerase dan RNAi dalam membangun domain heterokromatik. Ketergantungan pada RNAi co-transkripsi memungkinkan pelepasan RNA polimerase dan mencegah tabrakan dengan mesin replikasi DNA sentromer. Bersama-sama studi ini menunjukkan kebutuhan untuk tidak hanya mengidentifikasi lncRNA yang terlibat dalam pembentukan epigenetik tetapi juga untuk memahami banyak lapisan regulasi yang saling terkait secara simultan.


Transkriptom noncoding manusia mengungkapkan peta 'noncodarnia'

Thomas Gingeras (Laboratorium Cold Spring Harbor) memberikan gambaran tentang kompleksitas transkriptom manusia yang dihasilkan dari upaya konsorsium ENCODE. Peta transkriptomik telah memperoleh resolusi yang belum pernah terjadi sebelumnya, mengungkapkan bahwa 76% genom kami ditranskripsi. Dengan rata-rata sekitar delapan transkrip per wilayah gen, kekayaan ENCODE telah mendefinisikan ulang hipotesis 'satu gen - satu fungsi' menjadi 'banyak transkrip - satu fungsi', atau mungkin banyak. Dengan menggunakan kumpulan data dan pendekatan pelengkap, Piero Carninci dan Riken OMICs Center telah memberikan wawasan baru tentang regulasi promotor lncRNA. Dengan pemetaan yang baik dari tutup 5' 7-metil guanosin pada RNA, kelompok tersebut telah menemukan bahwa 6 hingga 30% dari situs awal 5' transkrip tikus dan manusia dimulai dalam elemen berulang. Hebatnya, lebih dari 250.000 situs awal transkripsi yang diturunkan dari retrotransposon menunjukkan ekspresi spesifik jaringan dan kompartemen sel.

Leonard Lipovich (Wayne State University) dan rekan menambahkan 6.000 lncRNA ke katalog ini dengan memeriksa klon cDNA manusia yang tidak diklasifikasikan dan profil ekspresinya untuk menentukan apakah lncRNA ini berkontribusi pada fenotipe penyakit neurologis. Mereka menemukan bahwa lncRNA spesifik primata dan non-konservasi tertentu diekspresikan secara berbeda di daerah otak yang menunjukkan aktivitas tingkat tinggi. Beberapa lncRNA ini, antisense terhadap gen penyandi protein, dapat mengatur ekspresi tetangganya. Menenun kerumitan transkriptom dengan kompleksitas perkembangan dan kognisi tubuh mamalia, John Mattick (Institut Penelitian Medis Garvan) menyajikan contoh-contoh yang menekankan perlunya untuk lebih memahami keragaman lncRNA. Menggali ke kedalaman 'materi gelap dalam genom' menggunakan metode pengayaan penangkapan mengungkapkan tidak hanya banyak lncRNA baru dan isoformnya tetapi juga isoform dari mRNA pengkode protein yang dipelajari dengan baik seperti p53. Ratusan lncRNA terbukti berubah selama diferensiasi sel induk dan memiliki stabilitas transkrip yang mirip dengan mRNA, dan banyak yang terkait dengan kompleks epigenetik, menunjukkan bahwa kompleksitas ini tidak dapat diabaikan. secara masal sebagai gangguan transkripsi.


Fitur lncRNA

Panjang

Seperti dibahas di atas, transkrip non-coding yang tidak mengkodekan protein dan panjangnya lebih dari 200 nukleotida dikenal sebagai RNA non-coding panjang (lncRNAs). Panjang suatu lncRNA bisa lebih dari 2 Kb sedangkan potensial pengkodeannya kurang dari 100 asam amino [5]. Kaur dan rekan menunjukkan bahwa dalam genom manusia 20% dari kemajuan transkripsi akan dikaitkan dengan gen pengkode protein. Informasi ini menggambarkan bahwa lncRNA empat kali lebih panjang dari urutan RNA pengkode [5].

Lokasi dalam genom

lncRNA sebagian besar disimpan di daerah yang kurang terkonservasi dalam genom termasuk daerah intronik gen [51]. Selain itu, beberapa lncRNA dilaporkan ditranskripsi dari salah satu untaian sekuens DNA [61] di dalam lokus pengkode protein. Lokasi genomik lncRNA memiliki hubungan langsung dengan konservasi evolusionernya [52, 53]. Temuan penelitian dan diskusi ilmiah menunjukkan bahwa kebanyakan lncRNA secara evolusioner dilestarikan [54] namun pada tingkat yang lebih rendah dibandingkan dengan gen penyandi protein [55]. Menariknya, daerah-promotor dari lncRNA lebih dilestarikan dibandingkan dengan urutan lncRNA [56]. Adanya open reading frame pada beberapa lncRNA membuat molekul ini sulit dibedakan dengan RNA penyandi protein [17]. Gen lncRNA 'X Transkrip Spesifik Inaktif' (atau Xist), yang bertanggung jawab atas inaktivasi kromosom X, adalah contoh lncRNA yang terletak di dalam wilayah genom yang kurang terkonservasi [81].

Tindakan

Keluarga lncRNA yang berbeda menjalankan berbagai mode aksi untuk regulasi ekspresi gen dan sintesis protein. RNA non-coding (ncRNA) ini dapat bertindak sebagai perancah dalam domain sub-nuklir atau dapat memiliki struktur sekunder untuk berinteraksi dengan DNA, RNA, dan protein (http://www.exiqon.com/lncRNA). RNA non-coding panjang memiliki ekspresi spesifik sel. Telah dilaporkan bahwa transkripsi lncRNA individu terjadi pada waktu tertentu sehingga mereka dapat berfungsi sebagai sinyal molekuler untuk menanggapi beragam rangsangan [103].

Ci- dan trans-mengatur tindakan

Kategori spesifik RNA yang menunjukkan urutan-komplementer dengan transkrip RNA lain dikenal sebagai transkrip antisense alami (NAT). NS trans-NAT dan target masing-masing secara fisik terletak di lokus yang berbeda pada genom, seperti miRNA. Selagi cis-NAT dan targetnya terletak pada lokus yang sama, tetapi untaian DNA yang berlawanan. Cis-NAT ini pertama kali diidentifikasi pada virus, kemudian prokariota dan akhirnya pada eukariota. Pada eukariota (kecuali nematoda), sekitar 5-29% unit transkripsi terlibat dalam tumpang tindih [51]. NS cis-NAT ditranskripsi oleh RNApolymerase II yang menunjukkan keterlibatannya dalam pemrosesan mRNA. Interaksi transkrip sense dan antisense menunjukkan peran NAT dalam regulasi ekspresi gen. Selain itu, juga telah dilaporkan bahwa dalam kasus pembentukan hibrid RNA dan transkripsi lokus gen di kedua orientasi juga dapat menginduksi pembungkaman gen atau dapat memicu respon imun [108].

Perbandingan dengan miRNA

miRNA dan lncRNA, keduanya bersifat non-coding. miRNA adalah

22 nukleotida panjangnya dibandingkan dengan lncRNA 8-10 kali lebih panjang. Fungsi yang tepat dari lncRNAs belum jelas tetapi telah dilaporkan bahwa baik miRNA dan lncRNAs bertindak sebagai regulator untuk mengendalikan proses biologis pada represi pasca-transkripsi gen pengkode protein [101, 102, 105]. Selain itu, lncRNA juga dapat bertindak sebagai spons miRNA dan dapat mengurangi efek regulasinya pada mRNA [78]. Deteksi eksperimental genom manusia telah mengidentifikasi sekitar 2000 miRNA yang berbeda dan sekitar 50.000 lncRNA [15, 21, 34].


Pembentukan dan distribusi R-loop

R-loop adalah struktur tiga untai yang terdiri dari hibrid RNA𠄽NA dan untai DNA yang dipindahkan (Gbr. 1, lingkaran merah). Fitur R-loop telah dibahas secara ekstensif dalam beberapa ulasan yang sangat baik 2,5,6,17 . Secara singkat, struktur tiga untai biasanya, tetapi tidak secara eksklusif, terkait dengan transkripsi yang sedang berlangsung, dan hingga saat ini dianggap hanya ’produk sampingan’ dari transkripsi yang terjadi secara eksklusif di cis, di tempat transkripsi. Supercoiling negatif, dan karenanya meningkatkan kecenderungan untuk peleburan DNA (pemisahan untai) yang terjadi di belakang RNA polimerase memberikan kesempatan ideal bagi transkrip yang baru lahir untuk menyatu dengan untai templat komplementer dan membentuk loop-R. Meskipun hibrid RNA𠄽NA terus-menerus terbentuk dalam gelembung transkripsi RNA polimerase, kecil kemungkinannya R-loop hanyalah perpanjangan dari hibrida terbatas ini, melainkan terbentuk melalui invasi ulang ujung 5’ RNA ( Gambar 1 ). Hal ini didukung oleh struktur kompleks RNA polimerase yang menunjukkan bahwa RNA dan DNA diekstrusi dari kompleks pada saluran keluar yang berbeda, yang akan mencegah R-loop hanya diperpanjang 28 . Selain itu, penelitian terbaru menunjukkan bahwa pembentukan ko-transkripsi R-loop yang efisien membutuhkan ujung RNA bebas dan kemiringan GC (asimetri dalam distribusi guanin dan sitosin di antara untaian lihat di bawah) 29 . Hibrida RNA𠄽NA juga dapat terbentuk dalam trans ketika RNA diproduksi di tempat yang berbeda secara spasial ( Gbr. 1 ) 30 .

Metodologi untuk mendeteksi hibrid RNA𠄽NA sangat penting untuk memahami bagaimana R-loop diatur dan untuk memetakan di mana dan kapan mereka terbentuk dalam genom. Meskipun alat utama untuk mendeteksi hibrida RNA𠄽NA adalah antibodi S9.6 spesifik hibrida monoklonal 31 , reagen dan teknik alternatif telah muncul. Versi mati katalitik dari ribonuclease H1 (RNase H1 enzim yang dapat mendegradasi bagian RNA dari hibrida RNA𠄽NA), 29,32 atau domain pengikatan hibrid RNase H1 yang menyatu dengan protein fluoresen 33 dapat digunakan sebagai sensor hibrid. Ringkasan komprehensif dari pendekatan ini, bersama dengan diskusi tentang kelebihan dan kekurangannya, tersedia di referensi. 3,5,34 . Meskipun ada konsensus umum di mana hibrida terakumulasi, perbedaan antara studi mungkin karena metode deteksi hibrida yang berbeda. Salah satu fitur R-loop yang dilestarikan adalah sifatnya yang sementara. Ini pertama kali ditunjukkan dalam sebuah penelitian menggunakan ragi tunas, yang menunjukkan bahwa hanya dengan hilangnya kedua enzim RNase H, pewarnaan nuklir yang terdistribusi secara seragam dari hibrida DNA RNA dapat dideteksi 35 . Ini menunjukkan bahwa hibrida sering muncul, tetapi dengan cepat dihilangkan, setidaknya sebagian, oleh RNase H. Selanjutnya, selain RNase H, beberapa helikase telah terbukti berkontribusi pada resolusi hibrida, ditinjau dalam ref 3 . Pewarnaan S9.6 yang tersebar di seluruh nukleus juga menunjukkan bahwa hibrida RNA𠄽NA terbentuk di banyak lokus di seluruh genom 35 . Prediksi ini diverifikasi ketika sekuensing genome-wide-harboring loci dalam ragi mengungkapkan distribusi yang luas, termasuk kehadiran yang kuat dalam retrotransposon, telomer dan gen yang sangat diekspresikan, seperti RNA ribosom dan lokus tRNA dan ncRNA terstruktur lainnya (Gbr. 2 ).

R-loop telah dipetakan di seluruh genom di sejumlah spesies. Prediktor kehadiran R-loop yang paling umum adalah memang aktivitas transkripsi yang tinggi, R-loop ditemukan di daerah promotor, di mana mereka mempromosikan transkripsi dengan menginduksi demetilasi DNA, dan di daerah terminasi transkripsi, di mana mereka mempromosikan penghentian transkripsi. Fitur lain dari area kaya R-loop termasuk konten GC tinggi dan kemiringan GC, struktur g-quadruplex (G4), transkripsi antisense, dan wilayah tempat mesin replikasi dan transkripsi bertabrakan. Hibrida DNA RNA (dan mungkin R-loop) juga terbentuk di lokasi kerusakan DNA, terutama pada double-stranded break (DSB), di mana mereka mempromosikan perbaikan yang dimediasi rekombinasi homolog (HR) melalui perekrutan protein kerentanan kanker payudara 1 ( BRCA1). ncRNA, RNA non-coding snoRNA, RNA nukleolar kecil rDNA, DNA ribosom.

R-loop sangat diperkaya pada gen yang terkait dengan transkripsi anti-sense dan baru-baru ini terbukti secara langsung mempromosikan ekspresi anti-sense 36� (Gbr. 2), menunjukkan bahwa mereka memiliki peran regulasi dalam ekspresi gen (lihat di bawah). Meskipun satu penelitian, yang memasukkan pengobatan dengan S1 nuclease sebagai bagian dari protokol DRIP untuk menstabilkan hibrida melalui penghilangan untai yang dipindahkan, menunjukkan bahwa AT condong dan terutama poli(A) saluran mungkin menjadi hotspot pembentukan R-loop 37 , konsensus umum adalah bahwa, dalam ragi, urutan sendiri bukan merupakan penentu penting dari akumulasi R-loop, melainkan tingkat transkripsi di lokus. Memang, lokus R-loop-poor dapat diubah menjadi lokus kaya R-loop, hanya dengan meningkatkan tingkat transkripsi dengan mengubah promotor 37 . Ada kecenderungan untuk urutan kaya GC untuk menampung lebih banyak R-loop, namun penelitian yang sama mengungkapkan bahwa gen kaya GC biasanya lebih tinggi diekspresikan dalam ragi 36 . Dalam sel mamalia, kemiringan GC sangat mendukung pembentukan R-loop (lihat di bawah) (Gbr. 2). Namun, genom ragi tidak menampilkan banyak kemiringan GC, selain pada telomer. Pada tanaman, kedua daerah dengan kemiringan GC atau kemiringan AT diperkaya dengan R-loop 39 . Hubungan antara tingkat ekspresi yang tinggi dan R-loop menunjukkan bahwa tingkat transkripsi yang tinggi mendorong akumulasi R-loop, atau bahwa R-loop meningkatkan tingkat transkripsi yang tinggi. Seseorang juga dapat membayangkan loop umpan balik positif di mana transkripsi menghasilkan akumulasi R-loop, yang mendorong transkripsi lebih lanjut. Di sisi lain, penting untuk diingat bahwa R-loop dikenal sebagai penghambat transkripsi yang kuat dan menyebabkan penghentian polimerase 10 . Hubungan kontradiktif antara R-loop dan transkripsi menunjukkan bahwa kontrol ketat dari persistensi R-loop (waktu paruh) diperlukan untuk mempertahankan tingkat transkripsi yang tinggi, atau bahwa ada pemisahan spasial antara R-loop dan kerangka baca terbuka.

Sebuah studi dalam ragi menemukan sedikit tumpang tindih genom antara hotspot R-loop dan lokalisasi subunit RNA polimerase II (Pol II) 36 . Ini mengungkapkan bahwa pemetaan R-loop oleh DRIP dengan antibodi S9.6 tidak secara eksklusif mendokumentasikan transkripsi yang sedang berlangsung, melainkan bahwa beberapa R-loop dapat bertahan, atau terbentuk, pasca-transkripsi. Ini adalah indikasi awal bahwa R-loop mungkin lebih dari sekadar produk sampingan transkripsi dan menyarankan bahwa hibrida dapat terbentuk secara independen dari transkripsi, yaitu di trans, atau mempengaruhi transkripsi dari jarak jauh.

Mirip dengan ragi, dalam sel manusia dan tumbuhan, R-loop terakumulasi pada urutan berulang seperti elemen transposabel, DNA ribosom, sentromer, dan telomer 32,39� (Gbr. 2). Menariknya, pada manusia dan tumbuhan mereka juga menonjol di daerah promotor yang memiliki pulau CpG (CGI) 29,32,39,42 ( Gambar 2 ). CGI hadir dalam promotor sekitar 60% gen manusia. Salah satu karakteristik CGI adalah adanya kemiringan GC positif: pengayaan guanin di atas sitosin pada untai non-templat, hilir situs awal transkripsi (TSS). Lokalisasi R-loop yang lebih tepat dalam wilayah promotor mengungkapkan bahwa R-loop umumnya dibatasi antara TSS dan persimpangan intron𠄾xon pertama 43 . Secara umum, kemiringan GC yang kuat berkorelasi dengan ekspresi gen yang tinggi dan dengan pengayaan R-loop. Akumulasi loop-R dengan cara spesifik urutan ini mungkin disebabkan oleh sifat pengikatan termodinamika yang sangat kuat dari RNA kaya-G ke urutan komplementer 44,45 . Selain itu, keberadaan struktur sekunder DNA seperti G-quadruplexes (G4s) pada DNA yang dipindahkan dapat berkontribusi pada stabilitas R-loop 46 (Gbr. 1), baik dengan mencegah akses protein penyelesaian R-loop atau dengan mengurangi re- kapasitas anil DNA. Baru baru ini in vitro studi menggunakan mikroskop kekuatan atom menunjukkan bahwa R-loop dapat mencapai struktur sekunder secara independen dari kehadiran G4 47 . Struktur sekunder ini terbentuk pada untai DNA yang dipindahkan, dan termasuk 𠆋lobs’, ‘spurs’ dan ‘loop’. ‘R-loop Objects’ seperti itu memaksakan batasan fisik lokal pada DNA di sekitarnya, misalnya dengan membengkokkan DNA. Kemungkinan yang menarik adalah bahwa objek R-loop dapat mengkodekan informasi peraturan tingkat tinggi, misalnya dengan merekrut pengubah kromatin yang berbeda. Di masa depan, penting untuk memastikan apakah objek R-loop seperti itu ada dalam konteks kromatin in vivo.

Kehadiran kuat R-loop dalam promotor gen adalah indikasi pertama bahwa struktur ini mungkin memiliki fungsi pengaturan gen yang penting. Selain daerah promotor, studi seluruh genom menemukan pengayaan R-loop yang cukup besar di situs terminasi transkripsi, terutama yang memiliki kemiringan GC. Hal ini sesuai dengan fungsi yang diusulkan dari R-loop dalam mempromosikan penghentian transkripsi 48,49 . Akhirnya, hibrida diproduksi di lokasi kerusakan DNA, termasuk di telomer disfungsional dan DSB (Gbr. 2), dan memiliki fungsi penting dalam mengkoordinasikan perbaikan DNA (diulas dalam 5 dan dibahas di bawah).

R-loop telah lama dianggap sebagai produk sampingan transkripsi yang tidak disengaja, merusak fisiologi seluler, dan hanya sumber ketidakstabilan genom jika tidak dihilangkan dengan benar 5,6 . Namun, baru-baru ini muncul bahwa ada kelas ‘peraturan’ R-loop yang bermanfaat, yang memiliki peran penting dalam berbagai proses biologis. Regulasi R-loop memanfaatkan spesifisitas urutan pasangan basa RNA-DNA untuk mengusir kofaktor dari, atau menargetkannya ke lokus kromosom yang berbeda.Contoh terpenting, dari prokariota, adalah sistem CRISPR (Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)�s9, yang telah berevolusi pada bakteri sebagai mekanisme pertahanan alami untuk mengenali dan menghancurkan elemen DNA asing yang berasal dari virus 50,51 . DNA virus yang telah diintegrasikan ke dalam susunan CRISPR dalam genom bakteri ditranskripsi dan dikaitkan dengan nuklease Cas9. Kompleks Cas9–RNA membentuk loop-R dengan urutan yang cocok pada DNA virus yang menyerang dan menghasilkan pemutusan DNA, yang pada akhirnya menghasilkan penghancuran DNA virus. Modul ini sekarang telah dimanfaatkan sebagai alat pengeditan gen yang sangat presisi dan mudah direkayasa menggunakan RNA pemandu untuk menargetkan Cas9 ke urutan spesifik dalam genom, sebuah proses yang melibatkan pembentukan R-loop dalam trans 52,53 .

Contoh pertama dari R-loop pengaturan endogen pada eukariota berasal dari studi tentang rekombinasi sakelar kelas di lokus rantai berat Ig 54 . R-loop yang terbentuk di dalam wilayah sakelar kaya-G mendorong penghapusan berbasis rekombinasi dan mendorong keragaman kelas antibodi 55,56 . Peralihan berbasis rekombinasi serupa yang terjadi di lokus glikoprotein permukaan varian (VSG) selama penghindaran kekebalan dalam trypanosom juga diatur oleh R-loop 57 . Spesifisitas urutan hibrida RNA𠄽NA memposisikan R-loop sebagai kandidat utama regulator ekspresi gen melalui penargetan yang tepat dari urutan promotor dan terminasi (Gbr. 2).


Pengantar

Adiposit putih bertanggung jawab untuk penyimpanan energi, sedangkan adiposit coklat dan krem ​​mengkhususkan diri dalam oksidasi bahan bakar dan pengeluaran energi. Kemajuan besar telah dibuat dalam menggambarkan kontrol molekuler perkembangan spesifik garis keturunan dari adiposit putih, coklat, dan krem ​​(1–3), remodeling dan peradangan jaringan adiposa (4–6), pengeluaran energi termogenik (7–9), dan baru-baru ini, fungsi endokrin yang muncul dari lemak coklat dan krem ​​(10,11). Peningkatan termogenesis adiposa sering dikaitkan dengan profil metabolisme yang lebih baik. Termogenesis lemak coklat dan krem ​​dimediasi oleh mekanisme uncoupling protein 1 (UCP1)-dependent dan UCP1-independen yang terakhir termasuk siklus substrat creatine (12-14) dan siklus kalsium sia-sia (15). Di luar termogenesis, lemak coklat dan krem ​​memberikan efeknya pada fisiologi metabolik melalui sekresi faktor endokrin dan eksosom yang mengandung mikroRNA yang bekerja pada jaringan lain dalam tubuh (10,11,16). Neuregulin 4 (Nrg4) adalah faktor yang disekresikan yang diperkaya lemak coklat yang melemahkan lipogenesis hati dan cedera hati (17-19), sedangkan microRNAs yang dienkapsulasi dalam eksosom dilepaskan oleh adiposit coklat dan dapat berfungsi sebagai pembawa pesan penting untuk intertissue cross-talk (20, 21). Jaringan adiposa dipersarafi secara padat oleh serabut saraf simpatis (22-24). Karya terbaru juga menjelaskan mekanisme yang mengatur persarafan simpatis adiposa dan plastisitas (25-28).

RNA noncoding panjang (lncRNAs) muncul sebagai pengatur penting pensinyalan seluler dan ekspresi gen dalam berbagai jenis sel. lncRNA adalah transkrip RNA panjang (>200 bp) yang tidak mengkode protein. Banyak lncRNA mengandung 5′ cap, multiple exon, dan 3′ polyadenylation (29). Beberapa transkrip ini bersifat intergenik sementara yang lain dihasilkan dari daerah genom yang dekat atau sebagian tumpang tindih dengan gen penyandi protein. Tergantung pada posisi relatif dengan gen pengkode terdekat, lncRNA secara umum dapat dikategorikan ke dalam lncRNA intergenik, antisense, divergen, intronik, dan penambah (29). lncRNA dapat mengatur fungsi sel melalui berbagai mekanisme. Misalnya, mereka dapat berfungsi sebagai perancah untuk membawa dua atau lebih protein ke dalam kompleks ribonukleoprotein fungsional, sebagai umpan untuk mentitrasi protein dari target aslinya, sebagai panduan untuk merekrut enzim modifikasi kromatin ke lokus spesifik pada kromosom, dan sebagai spons mikroRNA untuk buffer fungsi penghambatan microRNAs 'pada ekspresi gen (29,30). Patut dicatat bahwa potensi pengkodean lncRNA sering dinilai dengan metode komputasi berdasarkan panjang bingkai pembacaan terbuka, konservasi, penggunaan kodon, dll. Prosedur ini bukan bukti kesalahan dan mungkin salah mengartikan beberapa transkrip pengkode mikropeptida sebagai lncRNA (31). Oleh karena itu penting untuk secara eksperimental menentukan potensi pengkodean kandidat lncRNA.

Beberapa tahun terakhir telah terlihat peningkatan pesat dalam jumlah studi lncRNA adiposit yang berfokus pada anotasi lncRNA di seluruh genom, analisis molekuler dan fungsional dalam adiposit yang dikultur, dan, baru-baru ini, studi in vivo untuk menggambarkan peran mereka dalam fisiologi dan penyakit. Di sini, kami berusaha untuk menyoroti kemajuan terbaru dalam penelitian lncRNA adiposa, mendiskusikan wawasan baru tentang antarmuka regulasi lncRNA-protein yang muncul, dan memberikan perspektif tentang tantangan saat ini dan arah masa depan bidang ini. Pembaca juga dirujuk ke beberapa ulasan lncRNA luar biasa lainnya yang mencakup jaringan metabolik tambahan (32–35).


Gen LncRNA dalam genom

Genom kompleks eukariota ditranskripsi secara luas dan upaya untuk mendefinisikan semua transkrip secara komprehensif telah mengarah pada gagasan bahwa sekitar setengah dari genom dapat ditranskripsi menjadi RNA dalam sel individu (Djebali et al., 2012). Unit yang menghasilkan RNA - gen - secara kasar dapat dikategorikan ke dalam dua biotipe utama: gen pengkode protein (PCG) dan gen pengkode non-protein (NCG). Kategori terbesar dan paling koheren adalah PCG, yang mengkodekan RNA yang berfungsi sebagai cetakan untuk semua peptida dan protein dalam sel. Kategori NCG adalah kumpulan yang sangat heterogen dan dapat dikelompokkan menjadi gen ncRNA kecil (RNA non-coding) dan ncRNA panjang (lncRNA), di mana istilah long mengacu pada panjang sewenang-wenang 200 nukleotida atau lebih. Secara khusus, gen lncRNA telah menarik banyak perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena jangkauan aksinya yang luas dan sebagian besar fungsinya belum dijelajahi. Sementara jumlah mereka dilebih-lebihkan setelah penemuan awal mereka, mirip dengan perkiraan berlebihan jumlah PCG pada awal proyek genom manusia (Lander et al., 2001), proyek kurasi saat ini dan hati-hati, seperti proyek GENCODE dan FANTOM, daftar 17.957 dan 27.919 gen lncRNA, masing-masing (Gambar 1A), dalam rilis data genom manusia terbaru mereka (Frankish et al., 2019 Hon et al., 2017). Oleh karena itu, jumlah gen lncRNA berada dalam kisaran yang sama, atau bahkan sedikit lebih tinggi, daripada jumlah PCG (19.954). Di masa depan, kelas NCG yang saat ini sangat heterogen ini dapat disubkategorikan lebih lanjut menjadi biotipe yang lebih spesifik.

Gen LncRNA dalam genom.

(A) Tinjauan gen dan nomor transkrip dalam genom manusia (GENCODE v35). Luas lingkaran mewakili besaran relatif. (B) Skema tiga kemungkinan sifat fungsional lokus lncRNA.

Saat ini, tiga prinsip fungsional utama dapat ditetapkan untuk lokus lncRNA (Gambar 1B): (1) RNA adalah biomolekul fungsional dan berinteraksi dengan komponen lain dalam sel, misalnya DNA, protein atau RNA, (2) pengatur gen elemen tertanam dalam badan transkripsi gen lncRNA dan aktivitas gen lncRNA mengarahkan aktivitas elemen pengatur atau (3) proses transkripsi mempengaruhi genom dan dengan demikian aktivitas gen. Sebuah lokus lncRNA dapat memiliki salah satu dari fungsi-fungsi ini atau campurannya (Yin et al., 2015). Dalam ulasan ini kami akan fokus pada dua sifat lncRNA fungsional terakhir, di mana RNA, setidaknya sebagian dapat dibuang untuk fungsi gen lncRNA.

Transkripsi gen

Generasi RNA menggunakan genom sebagai template, atau proses transkripsi, tergantung pada elemen genom fungsional tertentu (Gambar 2). Elemen inti dari gen yang memulai produksi RNA adalah promotor. Elemen kaya GC yang dapat diakses (kromatin terbuka) akan menarik mesin polimerase dan faktor transkripsi umum (TF). Elemen inti minimal ini berfungsi sebagai promotor inti dan cukup untuk memulai transkripsi (Deaton dan Bird, 2011). Transkripsi RNA dimulai di situs awal transkripsi (TSS), yang terletak di dalam promotor inti. Seperti PCG, sebagian besar lncRNA ditranskripsi oleh POL II (RNA polimerase 2, kompleks multiprotein), tetapi lebih spesifik jaringan dibandingkan dengan PCG (untuk tinjauan lihat Ransohoff et al., 2018). Kedua biotipe (PCG dan lncRNA) telah melestarikan urutan promotor inti dengan lebih sedikit motif pengikatan TF yang tumpang tindih dalam promotor lncRNA, menghasilkan tingkat ekspresi yang lebih rendah secara keseluruhan dibandingkan dengan PCG (Gambar 2 Mattioli et al., 2019). Dengan demikian, arsitektur promotor inti adalah pemain pertama yang menentukan derajat ekspresi lncRNA (Batut dan Gingeras, 2017 Mattioli et al., 2019). Elemen penting kedua yang mempengaruhi transkripsi gen adalah enhancer, yaitu: cis-elemen pengatur yang dapat memiliki dampak positif atau negatif (yang kemudian sering disebut sebagai represor) pada gen target mereka. Akibatnya, penambah adalah wilayah genom yang mengkodekan situs pengikatan untuk aktivator atau TF penekan urutan-spesifik. Unsur-unsur ini sering memberikan kekhususan dalam ekspresi spatiotemporal. Banyak lncRNA juga dapat dihasilkan dari elemen penambah tersebut, yang berkontribusi pada ekspresi spesifik jaringan secara keseluruhan jika dibandingkan dengan PCG (Mattioli et al., 2019).

Fitur yang membedakan generasi transkrip PCG dan lncRNA (A) LncRNA dan (B) mRNA: gen lncRNA diekspresikan dengan rendah karena lebih sedikit faktor transkripsi (TF) yang mengikat promotor.

Selain itu, lncRNA TSS, situs ekson dan/atau pA lebih sering dikaitkan dengan elemen transposable (TE), sedangkan TE sebagian besar berkontribusi pada UTR dan/atau intron mRNA. Selain itu, mRNA lebih efisien disambung.

Promotor inti memulai transkripsi dan dengan demikian menghasilkan RNA yang mungkin atau mungkin tidak terdiversifikasi lebih lanjut dengan penyambungan (Gambar 2). Ini tergantung pada apakah situs sambatan hadir antara promotor dan elemen terminasi transkripsi, sinyal poliadenilasi (pA). Mekanisme penyambungan PCG dan lncRNA serupa, meskipun efisiensi penyambungan lncRNA lebih rendah daripada PCG, kemungkinan karena hilangnya fosforilasi RNA POL II proksimal pada situs sambungan 5' (Krchnáková et al., 2019). Selain itu, lncRNA menunjukkan tanda-tanda pembelahan ko-transkripsi dan penghentian prematur dengan Thr4p PolII yang diperkaya di seluruh tubuh lncRNA (Schlackow et al., 2017). Pada titik tertentu mesin transkripsi akan mengalami sinyal terminasi, elemen urutan DNA yang terdiri dari AATAAA dan motif kaya GU (atau U) hilir (Eaton et al., 2020). Elemen-elemen ini ada di mana-mana dalam genom. Pada manusia, seseorang dapat menemukan 569.005 elemen yang memenuhi kriteria sinyal pA (301.001 pada mouse dan 20.931 pada C. elegan) (Herrmann et al., 2020). Selain itu, jumlah yang tinggi ini kemungkinan memastikan penghentian transkripsi yang berhasil (Eaton and West, 2020).

Kelas lain dari elemen genetik yang memainkan peran penting untuk gen dan aktivitas genom adalah elemen transposable (TEs) (untuk tinjauan lihat Chuong et al., 2017). Elemen genomik seluler ini membentuk lebih dari 44% genom manusia (Lander et al., 2001) dan menarik perhatian sebagai pengatur penting aktivitas gen dan genom (Bourque et al., 2018). Dalam hal ini, TE juga merupakan komponen penting dari biologi lncRNA (Gambar 2A). Kira-kira, 75% transkrip lncRNA mengandung elemen urutan dari TE (Kapusta et al., 2013) dan beberapa di antaranya mewakili elemen urutan penting untuk mengarahkan lokalisasi lncRNA (Lubelsky dan Ulitsky, 2018). Selain itu, 25% TE ditemukan tumpang tindih dengan sinyal TSS dan pA dari gen lncRNA (Kapusta et al., 2013). Oleh karena itu, mereka adalah kekuatan pendorong penting dari ekspresi lncRNA. Salah satu contoh terbaru adalah lncRNA . khusus primata XACT (Tabel 1), yang telah terbukti melindungi kromosom X aktif agar tidak dibungkam (antagonis). XIST lncRNA effect) dan yang urutannya mengandung elemen yang berasal dari TE (Casanova et al., 2019). Menariknya, XACT lncRNA juga diatur oleh elemen penambah turunan TE yang menampung situs pengikatan faktor pluripotensi pionir. Ini menunjukkan bahwa TE yang mengandung motif TF tertanam dapat mengarahkan ekspresi spesifik jaringan ketika mereka menyisipkan di sebelah elemen promotor. Beberapa lncRNA turunan TE lainnya dijelaskan di tempat lain (Kapusta et al., 2013).

Pemilihan gen lncRNA dengan fungsi independen RNA.
LncRNALokasi relatif dari masing-masing gen target TSSliteraturMode aksi
Elemen pengatur terletak di dalam unit transkripsi
Hantu (Halr1)40 kb hilir dari HOXAYin dkk., 2015Aktivasi HOXA
terkunci4 kb hilir dari Cdkn1bParalkar et al., 2016Regulasi positif dari Cdkn1b melalui formasi lingkaran
Meteor80 kb hulu dari EomeAlexanian et al., 2017Lisensi positif dari Eome ekspresi
TimoD844 kb hilir dari Bcl11bIsoda dkk., 2017Metilasi DNA, pengikatan CTCF
Pcdhα-sebagaiPCdhCanzio dkk., 2019Metilasi DNA, pengikatan CTCF
GAL10-ncRNAGAL10 transkrip antisenseHouseley dkk., 2008GAL10 asetilasi promotor
AIRN28 kb Antisense untuk Igfr2Latos dkk., 2012Metilasi promotor
Tangan Atas (Tangan2os1)0,1 kb hulu dari Tangan2Anderson et al., 2016 Han et al., 2019Mempromosikan aksesibilitas penambah untuk Tangan2 pengaktifan
Aktivitas yang dilakukan oleh inisiasi atau elongasi transkripsi
Ftx140 kb hulu dari XistFurlan dkk., 2018Xist aktivasi independen dari Ftx RNA
pemburu16 kb upstream dari Chd2Rom dkk., 2019Regulasi negatif dari Chd2
PVT152 kb hilir dari MycoCho dkk., 2018Elemen batas penambah
Tangan ke bawah (menangani)11 kb hilir dari Tangan2George dkk., 2019 Ritter dkk., 2019Perisai penambah berbasis elongasi transkripsi

Singkatnya, genom menyimpan informasi yang diperlukan untuk menghasilkan RNA yang diperlukan untuk fungsi sel yang tepat, apakah RNA pengkode protein atau tidak. Sebuah mesin rumit didirikan yang mengontrol aktivasi spesifik gen dan seluruh wilayah genom melalui mekanisme positif atau negatif. Mekanisme pengaturan ini membutuhkan investasi energi dari sel. Dapat dibayangkan bahwa kadang-kadang bisa 'lebih murah' bagi sel untuk membiarkan transkripsi palsu dari transkrip yang tidak berbahaya terjadi, mungkin itu pengkodean atau non-pengkodean, daripada menginvestasikan energi dalam membungkam semua situs aktif transkripsi ini.

Lapisan regulasi gen

Ekspresi gen dan seluruh wilayah genomik dikendalikan oleh beberapa lapisan regulasi. Selain elemen genom yang dijelaskan di atas, DNA dikemas dengan protein histon menjadi kromatin. Komponen protein ini dapat dimodifikasi untuk bertindak sebagai pusat pensinyalan untuk mesin transkripsi (untuk tinjauan lihat Talbert et al., 2019). Selain itu, protein nukleus juga mengatur susunan 3D DNA genom sedemikian rupa sehingga elemen-elemen regulasi gen yang terhubung secara fungsional bersatu. Singkatnya, setiap kromosom terdiri dari unit sub-megabase yang dikenal sebagai domain terkait topologi (TAD), unit struktural dan fungsional kromosom (untuk tinjauan lihat Szabo et al., 2019). Pengaturan genom semacam itu dapat memungkinkan kontak promotor-peningkat dan mengatur elemen regulasi yang bergantung secara fungsional bersama-sama (Hnisz et al., 2017). Faktor utama yang mengatur organisasi ini adalah CTCF (CCCTC-binding TF) dan kompleks kohesin (Ali et al., 2016 Rao et al., 2017). Pengikatan CTCF sering kali terlokalisasi dan berinteraksi dengan kompleks kohesin di perbatasan TAD (Li et al., 2020). Memang, penghapusan kohesin melarutkan semua TAD kromatin bahkan dengan adanya CTCF (Rao et al., 2017). Menariknya, gangguan TAD baik dengan menghilangkan CTCF atau kohesin menghasilkan efek ringan yang tidak terduga pada ekspresi gen (Nora et al., 2017 Rao et al., 2017). Meskipun telah diterima bahwa ekspresi gen dan pelipatan genom 3D berkorelasi, relevansi fungsionalnya masih harus dijelaskan (Ibrahim dan Mundlos, 2020).

Semua penambah dan daerah pengorganisasian genom ini harus diatur secara fungsional untuk secara akurat mengontrol aktivitas gen dan genom. Karena banyak situs pengatur seperti itu terkait dengan lncRNA, lokus lncRNA ini mungkin merupakan elemen pendukung fungsional yang penting. Proses transkripsi dapat membantu dalam mengatur ulang tanda kromatin (van Steensel dan Furlong, 2019), memungkinkan daerah dapat diakses untuk faktor lain atau mencegah orang lain dengan mengalihkan/mengarahkan mesin transkripsi ke gen terdekat.

Anotasi saat ini dalam database sedang dalam proses

Anotasi database genomik saat ini mengkategorikan gen menurut berbagai kriteria. Salah satu yang tampak, di permukaan, sangat sederhana adalah pemisahan gen pengkode protein (PCG) dan gen pengkode non-protein (NCG). Sudah ditemukan beberapa waktu lalu bahwa RNA yang berasal dari NCG benar-benar berasosiasi dengan ribosom, mesin yang menerjemahkan mRNA menjadi protein (Ingolia et al., 2011 van Heesch et al., 2014). Asosiasi ini tidak mengejutkan, karena fungsi ribosom adalah untuk mengikat RNA dalam sitosol dan mencoba menerjemahkannya menjadi peptida atau protein. Namun, hanya karena RNA terikat pada ribosom tidak berarti itu diterjemahkan dan bahkan jika diterjemahkan, keberadaan peptida murni tidak membuktikan fungsi peptida ini. Dalam studi mendalam yang lebih baru, ditemukan bahwa beberapa lncRNA memang menghasilkan peptida dan beberapa peptida ini bahkan berfungsi (Chen et al., 2020 Ji et al., 2015 van Heesch et al., 2019), termasuk dalam 5 'dan 3' daerah tidak diterjemahkan (UTR) dari mRNA. Oleh karena itu, sampai database diperbarui dengan informasi yang sesuai yang menggabungkan keberadaan peptida yang diturunkan dari RNA yang diekspresikan, probabilitas pengkodean peptida harus selalu dipertimbangkan saat mempelajari fungsi lncRNA. Sama pentingnya, banyak PCG atau NCG memiliki jumlah varian sambungan yang tinggi, beberapa di antaranya mungkin mengkodekan peptida dan yang lainnya tidak.

Revolusi pengurutan throughput tinggi dari perpustakaan cDNA yang terfragmentasi mengungkapkan kompleksitas ekspresi dari genom. Pengayaan transkrip yang diekspresikan rendah dan analisis urutan selanjutnya mengidentifikasi pola varian sambatan yang lebih kompleks (Mercer et al., 2012). Namun, analisis ini bergantung pada pengurutan pustaka cDNA yang terfragmentasi dan rekonstruksi transkriptom selanjutnya ke genom referensi. Generasi terbaru dari pengurutan baca panjang, seperti PacBio atau sistem Nanopore, memungkinkan analisis langsung RNA dan menghilangkan langkah perantara dari pustaka cDNA yang terfragmentasi.Menangkap gen lncRNA secara khusus dan mengurutkan ulang dengan platform Long-read (dikenal sebagai Capture Long Sequence atau CLS) menentukan variasi penuh varian sambungan transkriptom mamalia (Lagarde et al., 2017). Keuntungan dari teknologi ini adalah kemampuan untuk secara tepat menentukan ujung 5' dan 3' dan, idealnya, semua varian sambungan transkrip. Misalnya, perkiraan jumlah rata-rata ekson per lncRNA menggunakan CLS adalah 4,27 dibandingkan dengan 3,59 yang diukur dengan metode RNA-seq pembacaan pendek (Lagarde et al., 2017). Meskipun pendekatan ini tidak menghilangkan kebutuhan untuk secara hati-hati menentukan varian sambungan dari lokus lncRNA sepenuhnya, pendekatan ini memberikan titik awal yang sangat baik untuk analisis terperinci. Secara khusus, ketika data CLS tidak tersedia untuk locus-of-interest Anda atau jaringan-of-interest Anda, seseorang harus menentukan panjang transkrip penuh, varian sambatan dan elemen regulasi lncRNA-of-interest. Hanya dengan begitu strategi yang berhasil untuk mempelajari lncRNA dapat dimulai.

Regulasi gen oleh gen lncRNA – elemen regulasi dalam unit transkripsi

Mensurvei lansekap modifikasi kromatin dan DNA mengarah pada anotasi wilayah regulasi potensial di seluruh genom dan kadang-kadang bahkan untuk jaringan dan jenis sel tertentu. Elemen pengatur, apakah itu promotor atau elemen pengatur lainnya, dapat ditemukan di dalam atau jauh dari unit transkripsi gen. Terjadinya elemen pengatur seperti itu dalam unit transkripsi, misalnya gen lncRNA, dapat menunjukkan bahwa fungsi elemen ini mungkin dipengaruhi oleh aktivitasnya.

Salah satu contoh gen lncRNA menarik yang mencerminkan dualitas gen lncRNA sehubungan dengan mekanisme berbasis RNA mereka di satu sisi, dan elemen penambah di sisi lain, adalah Menghantui. Sedangkan RNA dari Menghantui dianggap diperlukan untuk regulasi negatif dari HoxA, NS Menghantui lokus berisi elemen regulasi untuk mengaktifkan HoxA lokus selama in vitro diferensiasi sel induk berpotensi majemuk (Yin et al., 2015). Meskipun terlihat bahwa enhancer ini dapat berinteraksi dengan HoxA secara langsung, elemen tidak didefinisikan lebih lanjut atau bagaimana fungsinya mungkin bergantung pada Menghantui aktivitas transkripsi.

Contoh awal serupa dari lokus lncRNA yang berisi elemen pengatur di dalam unit transkripsinya adalah terkunci lokus lncRNA, yang mengatur cis gen Cdkn1b. Penghapusan seluruh lokus terkunci, termasuk elemen hulu TSS, mengarah pada pengurangan Cdkn1b ekspresi (Paralkar et al., 2016). Sedangkan wilayah genomik 5’ dari terkunci berinteraksi secara genomik dengan promotor Cdkn1b, interaksi ini tidak berubah jika transkripsi terkunci dikuras oleh sinyal pA yang dimasukkan ke dalam ekson pertama terkunci. Dengan demikian, lokus genom itu sendiri penting sebagai elemen pengatur daripada aktivitas transkripsinya.

Bahkan jika elemen regulasi spesifik tidak dapat didefinisikan, analisis yang cermat dan diseksi genetik dari lncRNA dapat menunjukkan prinsip regulasi tersebut. TSS-nya Meteor Lokus lncRNA penting untuk melisensikan cis-lokasi gen Eome untuk aktivasi di mesendoderm (Alexanian et al., 2017). kurangnya Meteor ekspresi dengan penghapusan TSS menyebabkan hilangnya Eome aktivasi selama diferensiasi mesendoderm dari ESC tikus. Menurunkan level Meteor RNA selama proses ini tidak mengubah ekspresi gen hilir, menentang fungsi berbasis RNA dari Meteor. Menariknya, aktivasi endogen dari Meteor bukan hanya lisensi Eome aktivasi gen, tetapi juga gen mesodermal jantung lainnya. Selain itu, penghambatan transkripsi Meteor menggunakan penyisipan elemen poliadenilasi hilir dari Meteor TSS tidak menyebabkan Eome gen yang akan dibungkam selama diferensiasi mesendoderm (Alexanian et al., 2017 Engreitz et al., 2016). Temuan ini menentang mekanisme berbasis transkripsi dari Meteor dan menunjukkan bahwa lokus genomik Meteor memiliki elemen peraturan penting untuk membuat cis-terletak Eome gen yang dapat diaktifkan selama diferensiasi.

Contoh yang sangat baik dari lncRNA dengan elemen pengatur yang ditentukan dalam unit transkripsi adalah TimoD lokus lncRNA. Transkripsinya mencegah metilasi situs pengikatan CTCF yang terletak di dalam unit transkripsinya (Isoda et al., 2017 Gambar 3A). Pengikatan CTCF memungkinkan perulangan dari Bcl11b unit transkripsi dalam domain yang sama dengan daerah pengaktifan Bcl11b. Aktivasi ini hilang ketika transkripsi TimoD diblokir oleh penyisipan sinyal pA setelah ekson dua dan sebelum situs pengikatan CTCF dan, akibatnya, situs pengikatan CTCF dimetilasi (Gambar 3A). Oleh karena itu, aktivitas transkripsi memiliki efek struktural tidak langsung pada regulasi Bcl11b selagi TimoD RNA dapat dibuang.

Modulasi ekspresi gen oleh transkripsi lncRNA.

(A) Aktivitas transkripsi memodulasi metilasi DNA dan dengan demikian mengubah pekerjaan faktor pengikat DNA dalam tubuh gen, misalnya CTCF. Kompleks POL2 ditunjukkan dengan warna ungu. Stik drum hitam menunjukkan CpG yang dimetilasi, CpG stik drum putih yang tidak dimetilasi. (B) Ekspresi LncRNA mengubah aktivitas promotor (Prom.) dengan memodifikasi mis. asetilasi histon di situs TSS. (C) Perpanjangan transkripsi dapat mengaktifkan penambah yang siap di dalam tubuh gen mereka (hanya asetilasi yang ditunjukkan).

Situasi yang lebih kompleks dari beberapa transkrip antisense yang mengatur cis gen adalah Protocadherin alpha (PCdh) klaster. Variabel, ekspresi stokastik dari beberapa kluster Protocadherin menyediakan protein permukaan sel untuk pengenalan identitas seluler dalam sistem saraf untuk memungkinkan dendrit dan akson membedakan dari neuron sendiri dan neuron lain. Ekspresi stokastik ini sebagian diatur oleh daerah penambah distal. Gugusan PCdh menghasilkan tiga varian berbeda dari tiga TSS alternatif untuk mencapai ekspresi stokastik varian sambungan dari cluster ini. Ekson pertama dari masing-masing varian ini mengandung transkrip lncRNA antisense (Pcdhα-sebagai) (Canzio et al., 2019). Ekspresi lncRNA mendahului ekspresi PCG dan secara positif mengatur ekspresi PCG terdekat. Secara mekanis, PCdh lncRNA bertindak mirip dengan TimoD lncRNA (atas) (Gambar 3A). Ekspresi dari Pcdhα-sebagai varian mengarah pada demetilasi situs pengikatan CTCF di wilayah hulu PCdh PCG, sehingga memungkinkan pembentukan loop yang stabil dengan wilayah penambah distal dan efek positif pada ekspresi PCG.

Ada juga contoh gen lncRNA yang berada dalam entitas transkripsi yang berbeda dari cis gen sasaran. Di sini, bahkan lebih dapat dibayangkan bahwa aktivitas mereka berdampak pada gen tempat mereka tertanam. Salah satu contoh pertama adalah ncRNA di dalam GAL10 kluster gen dalam ragi Saccharomyces cerevisiae. Di bawah 0% galaktosa, TF Reb1 mengikat ke wilayah promotor GAL10-ncRNA antisense untuk GAL10 dan sepenuhnya mengaktifkan ekspresinya (Houseley et al., 2008). Satuan transkripsi dari GAL10-ncRNA tumpang tindih dengan TSS dari GAL10 dan GAL1, menyebabkan penghambatan GAL10 dan GAL1 gen dengan mempromosikan metilasi dan hipoasetilasi H3K36me3 tingkat tinggi pada GAL10 dan GAL1 promotor. Penambahan galaktosa ke blok media pertumbuhan GAL10-ncRNA ekspresi dan hiperasetilasi dari GAL10 dan GAL1 promotor, yang mengarah ke ekspresi gen yang mengkode protein fermentasi galaktosa (Gambar 3B).

Prinsip serupa ditunjukkan pada eukariota yang lebih tinggi di AIRN (antisens Igf2r RNA non-coding) lokus. TSS dari lncRNA AIRN terletak di intron kedua dari Igf2r PCG dan AIRN ditranskripsi antisense ke ifg2r. Transkripsi dari AIRN mengatur secara negatif Igfr2 (Santoro et al., 2013). Ketika transkripsi AIRN diblokir oleh penyisipan poliA sebelum promotor Igf2r, peraturan negatif ini dihapuskan (Gambar 3B). Namun, jika pA yang sama dimasukkan setelah promotor Igf2r, efek regulasi negatif ini pada Igf2r tidak diamati (Latos et al., 2012). Temuan ini mendukung hipotesis bahwa transkripsi AIRN, dan bukan produk RNA itu sendiri, penting untuk regulasi transkripsi Igfr2.

Transkripsi gen lncRNA yang mempengaruhi penambah adalah Tangan atas, yang diekspresikan secara divergen dari Tangan2 gen pengkode protein (Anderson et al., 2016). Hilangnya Tangan atas transkripsi menyebabkan hilangnya asetilasi histon di hulu Tangan2, termasuk pada penambah jantung. Akibatnya, pengikatan GATA4 ke penambah yang ditentukan sebelumnya (McFadden et al., 2000) berkurang, dan Tangan2 ekspresi di hati juga berkurang. Oleh karena itu, fenotip kehilangan fungsi Upperhand mirip dengan kehilangan jantung Tangan2 (Gambar 3A). Mutan tambahan dari Tangan atas buatlah gambaran yang lebih rumit tentang peran Tangan atas dalam mengaktifkan Tangan2. Penghapusan lengkap Tangan atas unit transkripsi yang mencakup semua wilayah regulasi yang diketahui dari Tangan2 gen juga, menyebabkan hilangnya Tangan2 Ekspresi 5'UTR (Han et al., 2019). Temuan ini menegaskan kehadiran penting Tangan2 mengaktifkan elemen genetik langsung di hulu TSS-nya, terlepas dari RNA apa pun yang berasal dari wilayah ini. Namun, penghapusan promotor dari Tangan atas menyebabkan hilangnya RNA-nya sambil membiarkan semua elemen lain di wilayah itu utuh, tetapi tidak berpengaruh pada Tangan2 ekspresi diamati dalam kasus ini. Selanjutnya, penghapusan dua ekson terakhir dari Tangan atas memiliki sedikit efek pada Tangan2 ekspresi. Sejauh ini mungkin ada elemen penambah yang tidak dicirikan di wilayah genom kedua ekson ini dan penghapusannya dapat memengaruhi Tangan2 ekspresi. Selain itu, meskipun Tangan atas RNA disarankan tidak diperlukan untuk in vivo fungsi, RNA menghasilkan peptida yang mungkin fungsional (van Heesch et al., 2019). Hasil-hasil yang entah bagaimana bertentangan ini menggarisbawahi kompleksitas regulasi Tangan2 gen.

Contoh-contoh ini menyoroti pentingnya memperhatikan dengan cermat seluruh lokus lncRNA yang menghasilkan RNA. Terjadinya elemen pengatur beranotasi atau penempatan faktor pengatur genom seperti CTCF dalam unit transkripsi dapat menjadi indikasi penting untuk mencari fungsi genomik lncRNA.

Regulasi gen oleh gen lncRNA – tindakan transkripsi berfungsi

Tidak adanya elemen pengatur dalam unit transkripsi dapat disebabkan oleh anotasi yang tidak lengkap atau faktor yang belum diketahui yang mengikat di sana, atau tindakan inisiasi transkripsi atau pemanjangan transkripsi penting untuk fungsi lokus lncRNA.

Salah satu contoh prinsip regulasi semacam itu berasal dari pekerjaan di XIST lncRNA, yang merupakan salah satu lncRNA asli yang telah dipelajari secara ekstensif (Brockdorff et al., 1992). Sementara XIST bertindak melalui RNA yang dihasilkan (Brannan et al., 1990 Brown et al., 1992), regulasi XIST, setidaknya sebagian, tidak. NS XIST Lokus lncRNA diapit oleh banyak lncRNA, dan salah satunya adalah Ftx lokus ditemukan 140 kb di hulu Xist (Chureau et al., 2002). Awalnya diusulkan bahwa Ftx RNA berfungsi untuk mengatur XIST (Chureau et al., 2011). Namun, analisis terperinci menemukan bahwa transkripsi Ftx, dan bukan RNA yang dihasilkan, penting untuk mengatur Xist (Furlan et al., 2018). Knockdown dari Ftx RNA tidak menyebabkan hilangnya Xist ekspresi, tetapi penghapusan promotor Ftx, dan kerugian konsekuen dari Ftx transkripsi, menyebabkan hilangnya Xist ekspresi. CRISPRi dari Ftx sama menyebabkan hilangnya Xist ekspresi, menunjukkan bahwa transkripsi Ftx adalah regulator positif dari Xist ekspresi. Satu kemungkinan adalah bahwa arsitektur genom 3D dapat diubah karena aktivitas transkripsi dari lokus genom (Gambar 4). Menariknya, promotor dari Xist dan Ftx diapit oleh situs yang diduduki CTCF. Namun, menghapus situs pengikatan CTCF saja di Ftx promotor tidak berpengaruh pada tingkat ekspresi Xist, dengan alasan bahwa pelipatan genom diinduksi oleh Ftx aktivitas tidak melibatkan pengikatan CTCF.

Perubahan interaksi genom oleh aktivitas lncRNA.

DNA: Kontak DNA dapat berubah pada aktivitas transkripsi di dekatnya, cis terletak gen lncRNA.

Contoh bagus lainnya adalah pemburu lokus lncRNA, yang terletak 16 kb di hulu Chd2 gen pengkode protein (Rom et al., 2019). Meskipun, knock-down dari pemburu RNA memang menyebabkan sedikit peningkatan Chd2 ekspresi, garis bukti tambahan menyimpulkan bahwa transkripsi gen lncRNA kemungkinan merupakan fungsi yang paling penting dari pemburu dalam mengatur Chd2 (Gambar 4). Selain itu, promotor pemburu berinteraksi dengan Chd2 promotor dalam analisis penangkapan konformasi kromosom. Setelah menghapus pemburu wilayah promotor, Chd2 promotor semakin berinteraksi dengan elemen penambah lainnya di hulu. Sebaliknya, jika badan gen dari pemburu dihapus, meninggalkan promotor utuh, perubahan dalam enhancer/Chd2-kontak promotor tidak diamati. Penjelasan yang masuk akal adalah bahwa aktivitas inisiasi transkripsi daripada perpanjangan transkripsi penting untuk regulasi Chd2 oleh pemburu.

Demikian pula, inisiasi transkripsi penting untuk PVT1 lokus lncRNA. NS Pvt-1 lncRNA awalnya ditemukan sebagai translokasi genom yang menyebabkan aktivasi Myco onkogen (Adams dan Cory, 1985). Awalnya, disarankan bahwa miRNA tertanam dalam transkrip lncRNA dari PVT1 penting untuk regulasi gen target (Wang et al., 2019). Ternyata itu PVT1 transkripsi memiliki fungsi RNA-independen juga. NS PVT1 locus mengkodekan beberapa transkrip dengan situs awal alternatif. Aktivitas TSS utamanya berfungsi sebagai elemen batas untuk melindungi MYC promotor dari aktivasi berlebihan oleh penambah yang terletak di dalam unit transkripsi PVT1 (Cho et al., 2018 Gambar 4). Aktivitas transkripsi penting untuk kapasitas perisai ini, tetapi tidak untuk perpanjangan transkripsi (Gambar 4). Ini tidak berarti bahwa miRNA yang dihasilkan oleh PVT1 tidak melayani fungsi, tetapi tampaknya aktivitas utama dari PVT1 lncRNA, dan efeknya pada MYC disampaikan oleh aktivasi transkripsi PVT1.

Selain itu Tangan atas lncRNA hulu dari Tangan2 (lihat di atas), ada Tangan2-mengatur lokus lncRNA hilir dari Tangan2. Kami awalnya mengkarakterisasi lokus ini dan menyebutnya Tangan ke bawah, karena lokasinya di hilir Tangan2. NS Tangan ke bawah lokus diekspresikan dalam jaringan yang sama dengan Tangan2 tetapi paling signifikan diekspresikan dalam jantung yang sedang berkembang. Kami telah menunjukkan bahwa transkripsi Tangan ke bawah penting untuk secara negatif mengatur ekspresi Tangan2 (Gambar 4). Selain itu, TF HAND2 mengikat dua situs berbeda di sekitar TSS dari Tangan ke bawah di jantung E9.5 yang sedang berkembang (Laurent et al., 2017). Ini menunjukkan bahwa HAND2 mengaktifkan wilayah penekannya sendiri dalam loop umpan balik negatif untuk mengontrol dosisnya. Namun, penghapusan wilayah TSS dari Tangan ke bawah, termasuk hanya satu dari situs yang ditempati HAND2, tidak menghasilkan peningkatan regulasi yang diharapkan dari Tangan2 (George et al., 2019). Beberapa, wilayah TSS potensial hadir di wilayah 5 ' Tangan ke bawah dan penghapusan satu atau TSS utama dapat menyebabkan munculnya transkrip alternatif (Lavalou et al., 2019). Oleh karena itu, masuk akal bahwa situs kedua yang ditempati HAND2 mungkin cukup untuk menginstruksikan transkripsi alternatif Tangan ke bawah salinan. Oleh karena itu, selama aktivitas transkripsi hadir di Tangan ke bawah wilayah, Tangan2 dapat diatur secara negatif dan tingkat ekspresinya disesuaikan. Dosis dari Tangan2 sangat penting karena hilangnya satu salinan dari Tangan2 gen, serta perolehan salinan tambahan dari Tangan2 gen, menyebabkan malformasi selama perkembangan (Tamura et al., 2014). Selain lokus lncRNA ini mengapit Tangan2 gen, penambah diduga tambahan diprediksi up- dan downstream dari Tangan2, menggarisbawahi regulome kompleks gen penting ini dalam perkembangan.

Sementara fungsi lncRNA pada tingkat transkrip menjadi semakin dipahami, menjelaskan mekanisme bagaimana lokus tersebut, yang fungsinya didasarkan pada tingkat transkripsi, menunjukkan efeknya (Tabel 1) masih dalam masa pertumbuhan. Meskipun daftar ini tidak jenuh, jumlah lncRNA yang setidaknya sebagian bertindak dengan mekanisme seperti itu akan meningkat di masa mendatang. Salah satu model yang sangat menjanjikan tentang bagaimana mereka dapat bertindak adalah mikrodomain fungsional. Dalam skenario seperti itu, mikrodomain ini mempromosikan kerjasama antara komponen yang berinteraksi seperti TF, co-faktor, regulator kromatin, RNA polimerase II, dan RNA non-coding, sehingga mengatur proses dasar regulasi gen. Mikrodomain semacam itu secara menguntungkan dibentuk oleh super-enhancer yang juga sering menghasilkan RNA, tetapi berfungsi pada tingkat transkripsi. Oleh karena itu, aktivitas transkripsi itu sendiri dapat mempengaruhi aksesibilitas kromatin, metilasi DNA, modifikasi histon, dan struktur kromatin orde tinggi.


RNA NONCODING PANJANG SEBAGAI REMODELER KROMATIN

Dalam dekade terakhir, struktur kromatin dan modifikasi histon telah muncul sebagai pengatur utama AS. Interaksi antara modifikasi histon, protein pengikat kromatin dan SF mungkin merupakan jaringan komunikasi yang kompleks antara kromatin dan RNA (100). Juga, ditunjukkan bahwa konteks kromatin mempengaruhi laju pemanjangan RNA polimerase II (Pol II) yang pada gilirannya mempengaruhi AS (101-102). Ini berarti bahwa regulasi epigenetik tidak hanya menentukan bagian mana dari genom yang diekspresikan, tetapi juga bagaimana mereka disambung (100). Beberapa lncRNA berpartisipasi dalam penentuan dan dinamika struktur kromatin, yang kemudian dapat memengaruhi keluaran penyambungan, terutama dengan: (i) interaksi langsung antara lncRNA dan DNA yang membentuk heterodupleks, (ii) perekrutan pengubah kromatin ke lokus tertentu, atau (iii) membentuk Organisasi 3D konformasi kromatin melintasi inti sel. Akhirnya, kami membahas bagaimana RNA kecil yang diturunkan dari lncRNA mengontrol remodeling kromatin dan dapat menentukan pola AS melalui mekanisme ini.

Regulasi penyambungan oleh dupleks DNA-RNA yang digerakkan oleh lncRNA

Circular RNAs (circRNAs) adalah molekul melingkar tertutup kovalen dari RNA untai tunggal, yang dihasilkan dari peristiwa penyambungan non-kanonik, yang disebut penyambungan balik. Peristiwa ini terdiri dari ligasi situs donor sambatan hilir secara terbalik dengan situs akseptor sambatan hulu dari pra-mRNA, menghasilkan molekul lncRNA melingkar. Transkrip melingkar ini berlimpah dan sangat stabil, dan mereka dapat secara efisien bersaing dengan pra-mRNA linier untuk mengenali kompleks protein penyambungan terkait (103). Misalnya, pada lalat dan manusia, SF MUSCLEBLIND dapat secara kuat dan spesifik mengikat circRNA yang berasal dari lokusnya sendiri, yang disebut circMbl (104). Dalam sel manusia, circRNAs dimodulasi secara dinamis oleh SF QKI selama EMT manusia (105), dan ditunjukkan bahwa dalam sel endotel manusia kejadian circRNAs berkorelasi dengan exon skipping di seluruh genom (106). Namun, mekanisme molekuler yang melibatkan circRNAs pada hewan sebagian besar masih belum diketahui.

Baru-baru ini didemonstrasikan di Arabidopsis bahwa circRNA dapat memodulasi AS dari gen induknya sendiri dengan berinteraksi langsung dengan DNA, membentuk hibrid RNA-DNA yang dikenal sebagai R-loop (107). Ekspresi berlebih dari circRNA dari ekson 6 dari SEPALLATA 3 (SEP3) gen meningkatkan akumulasi yang terjadi secara alami SEP3.3 isoform, yang terdiri dari ekson 6-skipped transkrip. SEP3 milik keluarga MADS-box (dinamai setelah anggota pendiri M CM1- A GAMOUS- D EFICIENS-S RF) dari protein pengikat DNA, dan terlibat dalam perkembangan bunga di Arabidopsis. Modulasi dari SEP3 splicing menimbulkan fenotipe homeotik pada bunga. Yang mengejutkan, exon 6 circRNA mampu menghasilkan loop-R dengan interaksi langsung dengan lokus genomiknya sendiri, yang selanjutnya mendukung gagasan bahwa konformasi kromatin memainkan peran utama dalam penentuan pola penyambungan (Gambar 4i). Karakterisasi R-loop di seluruh genom akan diperlukan untuk menilai seberapa luas mekanisme ini terjadi di seluruh Arabidopsis genom (108).

RNA noncoding panjang sebagai remodeler kromatin. (Saya) ekson 6 dari SEP3 gen ditranskripsi dan disambung kembali menjadi RNA sirkular. NS SEP3 circRNA secara langsung berinteraksi dengan DNA gen induknya, membentuk dupleks DNA-RNA yang dikenal sebagai R-loop dan mendorong lompatan ekson 6, sehingga akumulasi SEP3.3 isoform mRNA. (ii) Transkrip antisense dari FGFR2 gen, disebut sebagaiFGFR2 (merah), merekrut protein PRC2 EZH2 dan SUZ12 ke lokus induknya, memicu pengendapan H3K27me3 dan perekrutan H3K36 demethylase KDM2a. Kompleks ini meningkatkan deposisi H3K36me3 dan merusak pengikatan kompleks adaptor penyambungan kromatin MRG15–PTB ke ekson IIIb, yang akhirnya termasuk dalam mRNA matang (berwarna hijau). (aku aku aku) NEAT1 dan malat1 mengikat lokus umum dan berbeda yang ditranskripsi secara aktif di seluruh genom. Pengikatannya pada tubuh gen berbeda di antara mereka, mis. NEAT1 puncak pengikatan di situs awal transkripsi serta akhir lokus, sedangkan malat1 istimewa mengikat hanya pada akhir gen. Diusulkan bahwa MALAT1 dan NEAT1 mempromosikan pembentukan speckles nuklir dan paraspeckles terkait splicing, masing-masing, di sekitar situs transkripsi lokus yang ditargetkan.

RNA noncoding panjang sebagai remodeler kromatin. (Saya) ekson 6 dari SEP3 gen ditranskripsi dan disambung kembali menjadi RNA sirkular. NS SEP3 circRNA secara langsung berinteraksi dengan DNA gen induknya, membentuk dupleks DNA-RNA yang dikenal sebagai R-loop dan mendorong lompatan ekson 6, sehingga akumulasi SEP3.3 isoform mRNA. (ii) Transkrip antisense dari FGFR2 gen, disebut sebagaiFGFR2 (merah), merekrut protein PRC2 EZH2 dan SUZ12 ke lokus induknya, memicu pengendapan H3K27me3 dan perekrutan H3K36 demethylase KDM2a. Kompleks ini meningkatkan deposisi H3K36me3 dan merusak pengikatan kompleks adaptor penyambungan kromatin MRG15–PTB ke ekson IIIb, yang akhirnya termasuk dalam mRNA matang (berwarna hijau). (aku aku aku) NEAT1 dan malat1 mengikat lokus umum dan berbeda yang ditranskripsi secara aktif di seluruh genom. Pengikatannya pada tubuh gen berbeda di antara mereka, mis. NEAT1 puncak pengikatan di situs awal transkripsi serta akhir lokus, sedangkan malat1 istimewa mengikat hanya pada akhir gen. Diusulkan bahwa malat1 dan NEAT1 mempromosikan pembentukan speckles nuklir dan paraspeckles terkait splicing, masing-masing, di sekitar situs transkripsi lokus yang ditargetkan.

RNA noncoding panjang sebagai perekrut remodeler kromatin

Contoh AS spesifik sel yang dimediasi oleh lncRNA dikaitkan dengan transkrip antisense yang disebut sebagaiFGFR2. lncRNA sebagaiFGFR2 dihasilkan dari manusia FGFR2 lokus dan menginduksi AS spesifik epitel FGFR2 dengan mempromosikan modifikasi kromatin sendiri FGFR2 tempat. Diusulkan bahwa sebagaiFGFR2 merekrut pengubah kromatin secara khusus ke lokus ini, mungkin melalui heterodupleks RNA-DNA. Menariknya, penarikan kromatin dari biotinilasi sebagaiFGFR2 RNA menunjukkan bahwa pada ekspresi berlebihnya, sebagaiFGFR2 ditargetkan untuk FGFR2 lokus tepat di sekitar intron yang disambung secara diferensial ( 109). Pada sel epitel, sebagaiFGFR2 ditemukan untuk merekrut pengubah kromatin seperti protein kelompok Polycomb dan H3K36 demethylase KDM2a ke FGFR2 tempat. Akibatnya, menghasilkan lingkungan kromatin yang mencegah pengikatan regulator splicing penghambatan dan mendukung inklusi ekson IIIb (109). Protein terkait polycomb dan KDM2a secara berbeda direkrut bersama FGFR2 dengan cara spesifik tipe sel, berkorelasi dengan FGFR2 hasil penyambungan. Hipotesis peran langsung H3K27me3 dan komponen PRC2 EZH2 pada FGFR2 AS dibuang dengan mengekspresikan EZH2 dalam sel setelah knockdown KDM2a. EZH2 gagal menginduksi inklusi ekson IIIb tanpa adanya KDM2a, menunjukkan bahwa PRC2 mempromosikan inklusi ekson IIIb dengan mempertahankan level H3K36me2/3 rendah melalui perekrutan KDM2a. Lanskap epigenetik ini merusak pengikatan kompleks adaptor penyambung kromatin MRG15-PTB, yang biasanya menghambat masuknya ekson IIIb. Efek antagonis H3K36me3 dan H3K27me3 pada FGFR2 splicing menunjuk ke cross-talk yang dimediasi lncRNA antara modifikasi histone ini (109) (Gambar 4ii).

Juga, lncRNA terkait penyambungan yang disebutkan malat1 diidentifikasi sebagai pengatur utama status metilasi protein Polycomb 2 (Pc2), yang memengaruhi konformasi kromatin (110). Dilaporkan bahwa metilasi / demetilasi Pc2 menentukan relokasi gen kontrol pertumbuhan antara badan Polycomb (PcGs) dan butiran interkromatin (ICGs). Perilaku ini diatur oleh pengikatan Pc2 termetilasi dan tidak termetilasi ke dua lncRNA, TUG1 dan MALAT1, masing-masing terletak di PcG dan ICG. TUG1- dan MALAT1-protein terkait diidentifikasi dengan pull-down menggunakan RNA terbiotinilasi diikuti dengan analisis spektrometri massa. Pendekatan ini mengungkapkan bahwa MALAT1 RNA terikat tidak hanya pada SF pra-mRNA, tetapi juga pada ko-aktivator transkripsional dan histone methyltransferases/demethylases yang terkait dengan tanda histone aktif sedangkan TUG1 RNA juga secara spesifik mengikat sejumlah protein yang terlibat dalam represi transkripsi, termasuk histone methyltransferases/demethylases dan chromatin modifiers. Ternyata lncRNA ini memediasi perakitan beberapa co-repressor/co-aktivator, dan dapat mengubah tanda histone yang dibaca oleh Pc2 in vitro. Selain itu, pengikatan malat1 ke Pc2 yang tidak termetilasi mempromosikan SUMOylation dari faktor transkripsi E2F1, yang mengarah ke aktivasi program gen kontrol pertumbuhan. Karena itu, malat1 juga berpartisipasi dalam modulasi lingkungan remodeling kromatin dengan berinteraksi secara selektif dengan protein pengubah kromatin (110). Meskipun tidak ada bukti adanya hubungan langsung antara MALAT1- atau TUG1modulasi dan penyambungan kromatin yang dimediasi, penelitian di masa depan akan diperlukan untuk menentukan apakah fungsi terkait kromatin dari lncRNA ini akibatnya dapat mempengaruhi AS gen target.

RNA noncoding panjang membentuk organisasi genom tiga dimensi

Jalur molekuler yang menghubungkan tindakan lncRNA spesifik struktur subnuklear, seperti TUG1 dan MALAT1, dan metilasi protein non-histone ke relokasi spasial unit transkripsi dalam nukleus, mengisyaratkan peran lncRNA dalam konfigurasi 3D dinamis genom di inti sel. Organisasi spasial nuklir dan modulasi 3D kromatin oleh lncRNA (37, 111–116) serta modulasi AS dengan modifikasi kromatin (untuk tinjauan lihat (100, 117)) telah lama dijelaskan dalam sel mamalia dan juga tanaman.

lncRNA terkait penyambungan NEAT1 dan malat1 digunakan sebagai umpan untuk memetakan situs pengikatannya di seluruh genom manusia (118) oleh Capture Hybridization Analysis of RNA Targets (CHART (119)). Menariknya, NEAT1 dan malat1 melokalisasi ke ratusan lokus dalam sel manusia, terutama pada gen yang ditranskripsi secara aktif. Banyak dari lokus ini diperkaya bersama dalam NEAT1 dan malat1 CHART, meskipun menampilkan pola pengikatan tubuh gen yang berbeda, menunjukkan fungsi independen tetapi saling melengkapi untuk kedua lncRNA. BAGAN diikuti oleh spektrometri massa juga dilakukan untuk mengidentifikasi NEAT1 dan malat1 interaktor, mengungkapkan spekel nuklir umum dan komponen paraspeckle. Penjelasan kompleks ribonukleoprotein lebih lanjut mendukung pengikatan komplementer dan fungsi yang diberikan oleh kedua lncRNA. Interaksi dinamis antara bintik-bintik nuklir dan badan gen menunjukkan bahwa bintik-bintik dapat berfungsi sebagai reservoir terkonsentrasi SF yang berpindah ke gen yang ditranskripsi (120, 121). Mempertimbangkan bahwa bintik-bintik sering terlokalisasi di sekitar gen yang ditranskripsi secara aktif yang menjalani penyambungan ko-transkripsi (122, 123), diusulkan bahwa badan nuklir dapat diatur di sekitar gen yang diatur oleh NEAT1 dan malat1 ( 118). Penjelasan sebelumnya tentang organisasi kromatin 3D sel manusia menunjukkan bahwa MALAT1 dan NEAT1 lokus genomik terletak berdekatan di dalam nukleus (124). Menurut model ini, NEAT1 dan malat1 dapat membentuk struktur badan nuklir di lokus yang sangat ditranskripsi, seperti NEAT1 juga berpartisipasi dalam organisasi pembentukan paraspeckle di sekitar lokasi transkripsinya (111, 112) (Gambar 4.iii). Kalau tidak, NEAT1 dan malat1 dapat berfungsi sebagai perancah, seperti: Xist atau UDARA PANAS (119, 125, 126), membawa protein yang juga berinteraksi dengan komponen bintik dan paraspekel nuklir, bersama dengan protein pengikat RNA dan/atau DNA. Model ini menganggap aksi lncRNAs sebagai jembatan molekuler antara lokasi kromosom tertentu dan bintik-bintik nuklir dan parabintik ( 118).

RNA kecil dalam interaksi antara penyambungan dan pemadatan kromatin

ncRNA kecil (smRNA) yang berasal dari prekursor lncRNA bertindak sebagai molekul kecil <50 nt. Sejak penemuan pembungkaman gen yang dimediasi RNA oleh RNA pengganggu kecil (siRNA) ( 127, 128), kelas RNA kecil lainnya dengan banyak fungsi telah diidentifikasi, seperti microRNA (miRNA) ( 129), fragmen RNA kecil yang berasal dari tRNA (tsRNA) dan fragmen RNA kecil yang berasal dari RNA nukleolus kecil (sno) (sdRNA, RNA turunan sno) (130, 131). Telah ditunjukkan bahwa mereka mengatur ekspresi gen dengan berbagai mekanisme, seperti menargetkan pembelahan mRNA, represi translasi atau transkripsi, umpan mRNA atau melalui generasi smRNA sekunder lainnya (132-134) dan penyerapan atau titrasi protein (135). Selama pembungkaman gen transkripsi, siRNA memicu pembentukan heterokromatin pada sekuens target DNA. Berbagai penelitian tanaman dan ragi telah melaporkan hubungan antara penyambungan dan pembungkaman yang dimediasi oleh pembentukan heterokromatin yang diarahkan smRNA. Secara khusus, beberapa mutan dalam gen penyandi SF ternyata juga terganggu dalam pembungkaman gen tertentu (136–140). Di dalam Schizosaccharomyces pombe, mutasi pada salah satu dari dua gen penyandi SF Cwf10 atau Prp39 ditemukan untuk mengurangi akumulasi siRNA sentromer dan untuk meningkatkan transkrip berulang seperti dg dan dh ( 136). Dengan cara yang sama, mutasi satu nukleotida pada gen snRNA U4 merusak pembungkaman sentromer ( 137). Dalam kedua kasus, beberapa SF ditemukan untuk memfasilitasi produksi siRNA untuk memodulasi pembentukan heterokromatin dan menginduksi pembungkaman sentromer. Demikian pula, dalam Arabidopsis SF SR45 ditemukan terlibat dalam de novo metilasi oleh jalur metilasi DNA yang diarahkan RNA (RdDM). Sebenarnya, sr45 mutan menurunkan siRNA dan metilasi DNA dalam transgenik FWA (BUNGA WAGENINGEN) di perusahaan dengan fenotipe berbunga akhir terkait (138). Contoh lainnya adalah Arabidopsis RIBONUCLEOPROTEIN D1 NUKLIR KECIL (SmD1) yang diusulkan untuk berperan dalam tanaman selama penyambungan karena mutan menunjukkan perubahan AS dari gen tertentu. Protein ini juga ditemukan untuk memfasilitasi pembungkaman gen pasca-transkripsi (PTGS) dengan melindungi RNA penyimpangan transgen dari degradasi oleh jalur NMD. Akibatnya, template yang cukup disediakan untuk produksi siRNA yang membangun hubungan antara RNA yang menyimpang dan AS (141). Terlepas dari contoh interaksi antara mesin penyambungan dan pembentukan heterokromatin yang diarahkan smRNA, studi baru juga menunjukkan hubungan yang melibatkan smRNA dalam regulasi AS melalui remodeling kromatin, sebuah proses yang dapat diatur oleh smRNA. Itu ditunjukkan pada manusia, lalat dan cacing bahwa kepadatan nukleosom lebih tinggi di atas ekson daripada intron menunjukkan bahwa posisi nukleosom mendefinisikan ekson pada tingkat kromatin (142-146). Konteks kromatin mempengaruhi laju pemanjangan RNA polimerase II (Pol II) yang pada gilirannya mempengaruhi AS (100-102). Transkripsi cepat mendukung lompatan ekson sedangkan transkripsi yang lebih lambat merangsang penggunaan situs sambungan lemah dari varian ekson yang mempromosikan proses inklusi intron atau situs alternatif lain untuk reaksi penyambungan (146, 147). Misalnya, FIBRONEKIN 1 gen (FN1) menghasilkan isoform protein yang berbeda melalui AS dari domain ekstra ekson I (EDI). Dalam sel hepatoma dan HeLa, dijelaskan bahwa siRNA terapan eksogen yang menargetkan sekuens gen yang terletak dekat dengan ekson alternatif EDI menyebabkan keadaan heterokromatik di lokasi yang mempengaruhi efisiensi pemanjangan Pol II dan memediasi AS dari EDI (148). Regulasi ini ternyata bergantung pada ARGONAUTE 1 (AGO1), yang merupakan aktor penting dalam pembungkaman RNA, mengikat siRNA untuk mengenali RNA target mereka. Contoh lain dari AS yang dimediasi oleh siRNA adalah dimasukkannya ekson 18 dari MOLEKUL ADHESI SEL SARAF (NCAM) gen yang diatur oleh tanda heterokromatin setelah diferensiasi sel saraf N2a tikus. Proses ini juga dapat diinduksi oleh aplikasi eksogen siRNA yang ditargetkan secara ekson dalam sel N2a yang tidak berdiferensiasi (149). Contoh-contoh ini menunjukkan bahwa siRNA dapat mengatur AS melalui modulasi heterokromatin di situs tertentu untuk menyempurnakan tingkat perpanjangan Pol II. Selain implikasi mekanistik dari penggunaan siRNA terapan eksogen ke ekson alternatif spesifik, pendekatan luas genom mengisyaratkan potensi relevansi mekanisme ini dalam kondisi fisiologis (150). Hebatnya, pemurnian kompleks terkait kromatin AGO1 dan AGO2 mengungkapkan interaksi mereka dengan SF. Lebih lanjut, kira-kira sepertiga dari smRNA yang dimuat dalam kompleks AGO1 dan AGO2 ini berjajar secara spesifik dengan 3' ujung intron, persimpangan intron-ekson ( 150). Pengamatan ini menunjukkan bahwa smRNA terkait intron dan mesin protein RNAi ini dapat memiliki fungsi dalam regulasi AS. Selain itu, susunan ekson lebar genom pada fibroblas embrionik lalu2- atau Pemain dadutikus -null menunjukkan bahwa mereka memiliki peristiwa AS yang diubah serupa ( 150). Dalam karya ini, CD44 gen diambil sebagai model untuk mengkarakterisasi mekanisme yang mendasari karena beberapa ekson alternatifnya dapat sangat disertakan dengan pengobatan phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA) (150, 151). Dalam sel mamalia yang diobati dengan PMA, smRNA merekrut AGO1 dan AGO2 ke daerah transkripsi CD44 dengan cara yang bergantung pada Dicer dan HP1 (HETEROCHROMATIN PROTEIN 1), yang meningkatkan level H3K9me3 lokal di wilayah yang sesuai dengan variabel ekson. Selanjutnya, protein AGO memfasilitasi perekrutan spliceosome dan modulasi prosesitivitas Pol II untuk membentuk CD44 AS (150), lebih lanjut menunjukkan keterlibatan smRNA dalam regulasi penyambungan. Regulasi heterokromatin oleh smRNA banyak ditemukan pada organisme yang berbeda di antara ragi, tumbuhan, dan mamalia. Oleh karena itu, ada kemungkinan bahwa interaksi antara splicing dan jalur smRNA/heterochromatin adalah mekanisme yang tersebar luas pada eukariota untuk dengan cepat mengatur splicing dan tingkat AS dari gen spesifik sepanjang pertumbuhan dan diferensiasi.


Latar belakang

Kekeringan merupakan salah satu faktor penting yang membatasi produktivitas dan kelangsungan hidup tanaman. Karena perubahan iklim global yang sedang berlangsung, semakin banyak penelitian yang berfokus pada pemahaman mekanisme bagaimana tanaman menahan tekanan kekeringan dan meningkatkan tingkat ketahanannya [1,2,3,4,5,6,7,8]. Tanaman merasakan sinyal kekeringan dan menghasilkan zat pembawa pesan kedua, seperti Ca2+, fosfatidilinositol dan spesies oksigen reaktif (ROS) [9, 10], sementara menyebabkan peningkatan konsentrasi ion kalsium intraseluler, memulai jaringan kaskade jalur fosforilasi protein. Akhirnya, protein target terlibat langsung dalam perlindungan sel, atau mengatur ekspresi serangkaian gen terkait stres spesifik melalui TF (MYC/MYB, ABF, CBF/DREB, bZIP, dll.), sehingga melindungi sel dan meningkatkan daya tahan tanaman terhadap kesulitan [11,12,13]. Meskipun perkembangan pesat dalam biologi molekuler modern secara bertahap mengungkap mekanisme molekuler ketahanan tanaman terhadap kekeringan, mengembangkan tanaman tahan kekeringan untuk mengatasi cekaman kekeringan akan tetap menjadi tantangan substantif di masa depan.

Long non-coding RNA (lncRNA) adalah jenis transkrip RNA yang panjangnya lebih dari 200 nukleotida dan tidak memiliki atau kemampuan pengkodean protein terbatas [14,15,16]. Semakin banyak bukti telah menunjukkan bahwa lncRNA mengerahkan efek pengaturannya pada tingkat ekspresi gen, yang melibatkan regulasi epigenetik, regulasi transkripsi, dan regulasi pascatranskripsi dalam bentuk RNA [17,18,19,20,21,22,23,24, 25]. Dengan keunggulan teknologi sekuensing generasi berikutnya dan pendekatan bioinformatika, banyak lncRNA telah ditemukan di pabrik model, seperti Arabidopsis [26,27,28,29], gandum [30], jagung [31,32,33] dan beras [34], menunjukkan bahwa lncRNA memainkan peran penting dalam berbagai proses biologis perkembangan tanaman dan respons stres. Penelitian terbaru telah mengkonfirmasi bahwa lncRNA merespons cekaman abiotik [31, 35, 36], termasuk cekaman kekeringan. Misalnya, 664 lncRNA yang responsif terhadap kekeringan dianalisis dalam jagung [31]. Di bawah tekanan kekeringan, 2542 kandidat lncRNA telah diidentifikasi dari Populus trichocarpa, 504 di antaranya ditemukan responsif terhadap kekeringan [37]. Di dalam Arabidopsis, 1832 lncRNA berubah setelah 2 jam dan/atau 10 jam perlakuan kekeringan, dingin, tinggi garam, dan/atau asam absisat (ABA) [29]. Pada jagung, 664 transkrip dikonfirmasi sebagai lncRNA yang responsif terhadap kekeringan, 8 di antaranya terbukti sebagai prekursor miRNA [31]. Pada padi, profil ekspresi pra-miRNA menunjukkan bahwa miR171f terlibat dalam perkembangan perkembangan dan pertumbuhan akar padi, serta respon terhadap cekaman kekeringan [38]. Pada kapas, long intervening / intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) XLOC 063105 dan XLOC 115463, terlibat dalam respon cekaman kekeringan dengan mengatur gen tetangga [39]. Lebih lanjut, 19 lncRNAs (17 lincRNAs dan 2 natural antisense transcripts (NATs)) dalam foxtail millet menanggapi stres kekeringan yang diinduksi oleh polietilen glikol-6000 (PEG), hanya satu dari lncRNA yang responsif terhadap kekeringan yang bersinergi dengan mitra sorgumnya [40] . Qin dkk. (2017) mengidentifikasi Arabidopsis lncRNA, lncRNA yang diinduksi kekeringan (DRIR), yang merespons kekeringan dan stres garam. DRIR dapat diaktifkan secara signifikan oleh kekeringan dan cekaman garam serta dengan perlakuan asam absisat (ABA) [41]. Selain itu, dalam singkong, 318 lncRNA diidentifikasi, yang responsif terhadap stres dingin dan/atau kekeringan, dan yang terkait dengan transduksi sinyal hormon, biosintesis metabolit sekunder, dan jalur metabolisme sukrosa [42]. Selain itu, banyak lncRNA yang terlibat dalam regulasi ekspresi gen sebagai respons terhadap stres telah diidentifikasi dan dikarakterisasi dalam Brassica [43,44,45,46]. Dalam kubis Cina (Brassica rapa ssp. chinensis), 4594 lncRNA diduga diidentifikasi untuk menanggapi stres panas, 25 di antaranya diekspresikan bersama dengan 10 gen responsif panas [47]. Di dalam Brassica rapa L., 549 lncRNA diidentifikasi secara signifikan mengubah ekspresinya sebagai respons terhadap perlakuan dingin, dan perlakuan dingin jangka pendek menginduksi transkrip antisense alami (NAT) di BrFLC dan BrMAF gen yang terlibat dalam vernalisasi diidentifikasi [48]. Summanwar dkk. (2019) mengidentifikasi 530 lncRNA yang diekspresikan secara berbeda dari akar clubroot-rentan dan -resisten Brassica napus garis. Dua puluh empat lncRNA yang diekspresikan secara berbeda diidentifikasi dari kromosom A08 yang telah dilaporkan memberikan resistensi terhadap berbagai P. brassicae patotipe [49]. Di dalam Brassica juncea, 1614 mengekspresikan respons lncRNA secara berbeda terhadap stres panas dan kekeringan, dan beberapa lncRNA diekspresikan bersama dengan TF yang terlibat dalam respons stres abiotik [50].

rapeseed (Brassica napus L.) merupakan tanaman biji minyak penting di dunia [51]. Hal ini rentan terhadap kekeringan, yang mempengaruhi produksi rapeseed secara substansial [52,53,54]. Meskipun banyak lncRNA telah ditemukan pada spesies tanaman yang berbeda, menunjukkan bahwa lncRNA dapat memainkan peran penting dalam menanggapi cekaman abiotik, identifikasi luas genom dan karakterisasi respons lncRNA terhadap cekaman kekeringan dan perawatan rehidrasi masih kurang, terutama di B. tidur siang. Untuk lebih memahami mekanisme molekuler dari respon B. tidur siang terhadap cekaman kekeringan dan penyiraman ulang, kami membandingkan perubahan transkriptom antara Q2 (genotipe toleran kekeringan) dan Qinyou8 (genotipe sensitif kekeringan) sebagai respons terhadap cekaman kekeringan dan perawatan rehidrasi pada tahap pembibitan, dan mengidentifikasi lncRNA yang terlibat dalam stres kekeringan dan perawatan rehidrasi. Penelitian ini menggunakan metode berbasis ekspresi bersama, di mana fungsi lncRNA diprediksi, berdasarkan fungsi gen penyandi protein yang diekspresikan bersama [55]. Oleh karena itu, jaringan koekspresi lncRNA-mRNA dibangun untuk analisis pengayaan jalur. Selain itu, jaringan koekspresi lncRNA-mRNA dari transduksi sinyal hormon tanaman dianalisis untuk mengeksplorasi lebih lanjut peran potensial lncRNA yang diekspresikan secara berbeda dalam menanggapi tekanan kekeringan dan penyiraman ulang.


Hubungan antara lncRNA makro dan pengulangan DNA - Biologi

Semua artikel yang diterbitkan oleh MDPI segera tersedia di seluruh dunia di bawah lisensi akses terbuka. Tidak diperlukan izin khusus untuk menggunakan kembali seluruh atau sebagian artikel yang diterbitkan oleh MDPI, termasuk gambar dan tabel. Untuk artikel yang diterbitkan di bawah lisensi Creative Common CC BY akses terbuka, bagian mana pun dari artikel dapat digunakan kembali tanpa izin asalkan artikel aslinya dikutip dengan jelas.

Makalah Fitur mewakili penelitian paling maju dengan potensi signifikan untuk dampak tinggi di lapangan. Makalah Fitur diajukan atas undangan individu atau rekomendasi oleh editor ilmiah dan menjalani tinjauan sejawat sebelum dipublikasikan.

Makalah Fitur dapat berupa artikel penelitian asli, studi penelitian baru yang substansial yang sering melibatkan beberapa teknik atau pendekatan, atau makalah tinjauan komprehensif dengan pembaruan singkat dan tepat tentang kemajuan terbaru di lapangan yang secara sistematis meninjau kemajuan paling menarik dalam bidang ilmiah. literatur. Jenis makalah ini memberikan pandangan tentang arah penelitian di masa depan atau kemungkinan penerapannya.

Artikel Pilihan Editor didasarkan pada rekomendasi dari editor ilmiah jurnal MDPI dari seluruh dunia. Editor memilih sejumlah kecil artikel yang baru-baru ini diterbitkan dalam jurnal yang mereka yakini akan sangat menarik bagi penulis, atau penting dalam bidang ini. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang beberapa karya paling menarik yang diterbitkan di berbagai bidang penelitian jurnal.


Pertimbangan ketika menafsirkan fenotipe yang dihasilkan dari mutasi lncRNA

Desain eksperimen fungsional harus dipandu oleh biologi RNA esensial dari lokus lncRNA yang dipilih: kedekatannya dengan gen pengkode protein, tanda tangan kromatinnya, stabilitas, nomor salinan, model transkrip panjang penuh dan profil ekspresi jaringan. Jika ia berbagi promotor dua arah, maka minimalkan gangguan dengan lokus yang berdekatan saat merancang strategi penargetan. Jika lebih banyak dan stabil, dengan tanda kromatin seperti promotor di situs awal transkripsinya, maka pertimbangkan apakah lncRNA bertindak dalam trans dengan cara yang bergantung pada RNA.

Pertimbangkan semua transkrip yang tersedia, elemen pengatur, dan bukti evolusioner saat merancang mutasi.

Pertimbangkan apakah, bertentangan dengan harapan awal, lncRNA mengkodekan protein atau, seperti untuk H19, menyimpan miRNA.

Pilihan strategi kehilangan fungsi dan prediksi apakah lncRNA bertindak dalam cis atau di trans harus diinformasikan oleh lokalisasi sitoplasma, nukleus atau kromatinnya. Jika ditemukan dalam sitoplasma, pertimbangkan apakah itu, pada kenyataannya, diterjemahkan. Jika berasosiasi dengan kromatin, pertimbangkan apakah ia bertindak dalam cis. Sebaliknya, jika sitoplasma atau nukleoplasma, pertimbangkan apakah itu trans-akting.

Pilih sel untuk eksperimen fungsional di mana lncRNA diekspresikan secara relatif tinggi, tentunya lebih dari satu molekul per sel.

Minimalkan gangguan urutan genom saat menyelidiki fungsi lokus lncRNA atau lncRNA. Gunakan manipulasi kontrol untuk membedakan gangguan yang memengaruhi gen yang mengapit dari yang memengaruhi lncRNA.

Selidiki setiap lokus menggunakan beberapa strategi pelengkap, misalnya pengenalan penghapusan DNA target minimal, inversi atau gangguan dan, secara terpisah, kaset pemotongan transkripsi. Pertimbangkan untuk menggunakan kontrol untuk manipulasi genetik lokus lncRNA: membalikkan kaset pemotongan jika memungkinkan, menggunakan kaset pemotongan bermutasi, menggunakan jenis kaset pemotongan yang berbeda, dan menggunakan situs yang berbeda untuk memotong lncRNA. Penting untuk menghapus kaset seleksi dan mempertimbangkan pengaruh gen reporter dan loxP situs di lokus. Gambarkan sepenuhnya lokus yang bermutasi, termasuk apakah kaset pilihan dipertahankan.

Uji biologis bereplikasi secara terpisah. Sel induk embrionik (ES) atau sel pluripoten terinduksi (iPS) sering bervariasi dalam kinetika diferensiasinya, terutama setelah menjalani penargetan dan seleksi gen, dan embrio tikus, terutama embrio tikus tahap implantasi awal, menunjukkan variasi yang cukup besar dalam waktu perkembangan. Demikian pula, garis sel kanker secara inheren tidak stabil secara genetik. Keragaman ini membuatnya penting untuk mempelajari banyak klon sel atau mutan yang diturunkan secara independen untuk memastikan bahwa efek yang diamati disebabkan oleh mutasi yang diinginkan, dan tidak bergantung pada efek lain dari latar belakang genetik. Ini sangat penting ketika efek fenotipik tidak kentara.

Penilaian bukti untuk fungsionalitas lncRNA

Pertimbangkan bukti untuk masing-masing dari banyak transkripsi atau pasca-transkripsi yang diketahui, nuklir atau sitoplasma, cis atau trans, mekanisme lncRNA yang bergantung pada RNA atau tidak bergantung.

Gunakan teknik berbasis RNAi terutama ketika menyelidiki RNA sitoplasma dan mekanisme yang bergantung pada RNA pasca-transkripsi. Jika menggunakan RNAi, efek knockdown pada kompartemen sitoplasma dan inti harus ditentukan secara terpisah. Alternatifnya adalah dengan menggunakan oligos DNA antisense untuk menginduksi aktivitas RNase H dalam nukleus.

Hanya klaim bahwa fenotipe disebabkan oleh perubahan a trans-bertindak transkrip lncRNA ketika berhasil dan berulang kali diselamatkan pada ekspresi lncRNA dari transgen independen.

Manfaatkan pendekatan biokimia yang dikontrol dengan hati-hati saat menilai fungsi potensial lncRNA.

Publikasi dan pelaporan

Menilai dan melaporkan secara objektif semua bukti untuk atau terhadap fungsi yang bergantung pada urutan RNA atau fungsi yang bergantung pada transkripsi (tidak bergantung pada urutan RNA).

Laporkan fenotipe dengan tepat. Umumnya, KO gen membunuh embrio pada periode kritis misalnya, implantasi, gastrulasi, 12,5 dpc ketika sistem kardiovaskular menjadi penting, dan saat lahir ketika paru-paru dan banyak sistem lainnya menjadi penting. Pada umumnya organ ibu menyelamatkan banyak cacat organ embrio. Untuk sel ES, fenotipe yang mempengaruhi pluripotensi perlu didefinisikan dan harus dipertimbangkan dengan hati-hati karena ketidakstabilan yang melekat pada keadaan ini.

Hati-hati secara eksplisit ketika bukti untuk fungsi RNA-dependent vs-independen, atau trans- vs cis-fungsi akting, tidak jelas.

Strategi kehilangan fungsi secara in vivo

Strategi kehilangan fungsi genetik yang berbeda dapat digunakan in vivo untuk mempelajari fungsi lncRNA (Gambar 2). Prioritas strategi harus bergantung pada biologi lncRNA yang diketahui, termasuk lokalisasinya ke satu atau lebih sitoplasma, nukleus atau kromatin. Dalam satu penelitian, sebagian besar lncRNA manusia diperkaya dalam sitoplasma (van Heesch et al., 2014) dan ini dapat dikaitkan dengan ribosom dan, bertentangan dengan harapan, beberapa dapat diterjemahkan (Guttman et al., 2013 Kim et al. , 2014 Wilhelm et al., 2014). lncRNA nuklir, terutama yang terkait dengan kromatin, dapat bertindak sebagai cisregulator transkripsi yang bertindak, sedangkan lncRNA sitoplasma atau nukleoplasma mungkin diprediksi berfungsi dalam trans sebaliknya, beberapa lncRNA nukleoplasma tentu saja merupakan produk non-fungsional dari transkripsi.

Strategi berbeda untuk analisis hilangnya fungsi lncRNA. Strategi yang telah digunakan untuk mengubah fungsi lncRNA dijelaskan secara gambar, dengan situasi tipe liar di baris paling atas.

Lokus lncRNA ditunjukkan dalam warna merah muda, gen penyandi protein tetangga berwarna biru, situs pengikatan faktor transkripsi di dalamnya oleh oval biru dan ungu, urutan terminator transkripsi berwarna kuning ('Istilah') dan proses transkripsi oleh garis putus-putus abu-abu. Oligonukleotida antisense mampu mengikat transkrip RNA yang baru lahir dan memicu degradasi transkrip yang dimediasi RNase H dalam nukleus. RNAi ditimbulkan oleh spesies RNA pendek yang mengikat protein argonaut (Ago, oval hijau) di dalam sel. Kompleks ini mengenali molekul lncRNA komplementer dalam sitoplasma, dan memicu destabilisasinya oleh mesin seluler endogen. Sistem CRISPR dan TALE menggunakan faktor pengikat DNA desainer untuk merekrut domain represor atau aktivator (oval oranye) ke lncRNA untuk memengaruhi inisiasi transkripsi. Efek dari setiap strategi pada proses transkripsi dan keberadaan elemen DNA yang mendasari seperti situs pengikatan faktor transkripsi ditunjukkan. Kemungkinan menghasilkan hewan transgenik yang stabil untuk menyelidiki fenotipe selama perkembangan juga dicatat.

Penipisan transkrip pengkodean protein sering dicapai dengan menggunakan teknik berbasis RNAi, yang memasok RNA untai ganda yang mampu memicu destabilisasi pasca-transkripsi mRNA matang dan menghambat terjemahan, terutama di sitoplasma. Meskipun keberadaan faktor RNAi aktif dalam inti sel manusia telah diusulkan (Gagnon et al., 2014) sejauh mana lncRNA nuklir eksklusif dapat dirobohkan masih belum jelas. Sementara berguna untuk studi banyak trans-acting lncRNAs, knockdown berbasis RNAi bertindak pasca-transkripsi, dan oleh karena itu tidak menghalangi tindakan transkripsi, menghalangi analisis lncRNA yang dapat menghasilkan efeknya melalui mekanisme ini.

Pendekatan eksperimental lainnya adalah memanipulasi lokus lncRNA secara genetik. Saat memasukkan urutan terminator transkripsi, perawatan harus dilakukan untuk mengontrol perubahan jarak antara elemen pengatur DNA dan untuk memperhitungkan elemen pengatur yang mungkin tidak sengaja dimasukkan, seperti promotor gen resistensi, karena ini mungkin dapat mendorong ekspresi gen tetangga. atau mengalihkan aktivitas dari enhancer terdekat. Penyisipan sekuens eksogen dapat menginduksi fenotipe (Steshina et al., 2006). Bahkan lajang loxP situs dapat menarik metilasi germline yang mungkin berpotensi menekan elemen regulasi mengapit (Rassoulzadegan et al., 2002). Kontrol ekstra dengan demikian diperlukan untuk mengidentifikasi kemungkinan efek gain-of-fungsi yang timbul dari urutan yang disisipkan, seperti reporter atau kaset pilihan. Munculnya nuklease yang dapat diprogram (Kim dan Kim, 2014) memberikan peluang untuk menyelidiki kemungkinan ini. Urutan terminator transkripsi dapat bervariasi dalam kemanjurannya tergantung pada konteks genom di mana mereka dimasukkan, yang dapat menyebabkan penghentian menjadi sangat tidak efisien. Misalnya, urutan yang secara efisien mengakhiri transkripsi dalam berbagai konteks di Airn, gagal melakukannya ketika dimasukkan dekat dengan pulau CpG (Latos et al., 2012).

Pendekatan lain termasuk penghapusan lokus lncRNA full-length atau urutan promotornya, mutasi domain fungsional diduga atau gangguan yang ditargetkan antara promotor dan urutan RNA melalui inversi yang direkayasa (Gambar 2 Tabel 1). Meskipun bermanfaat, strategi seperti itu mungkin tidak selalu berhasil. Pembalikan promotor, misalnya, mungkin tidak selalu membatalkan transkripsi, karena dua arah promotor (Wu dan Sharp, 2013), dan penghapusan promotor juga dapat mengganggu tingkat ekspresi transkrip pengkodean protein yang dengannya lncRNA berbagi promotor dua arah. Dalam semua kasus ini, penting untuk meminimalkan penghilangan atau reorganisasi situs pengikatan faktor pengatur atau elemen pengatur lain dalam DNA, dan untuk mengontrol penambahan situs pengikatan baru. Misalnya, harus diingat bahwa banyak lncRNA memulai dalam enhancer (Marques et al., 2013) dan dalam kasus ini gangguan promotor lncRNA juga dapat menyebabkan perubahan ekspresi gen yang tidak diinginkan. Dalam kasus terminator transkripsi, untuk memastikan efek disebabkan oleh perubahan RNA daripada DNA, inversi dari urutan terminator atau berbagai terminator yang berbeda dapat digunakan. Dalam desain eksperimental, penting juga untuk mempertimbangkan transkrip yang disambung secara alternatif dan situs awal transkripsi tambahan untuk memastikan pencabutan penuh ekspresi lncRNA.

Oligonukleotida antisense mungkin memberikan teknik alternatif untuk analisis fungsi lncRNA. Mereka dianggap bertindak dengan membentuk hibrid DNA/RNA dengan transkrip RNA yang baru lahir, dan memicu degradasi RNA yang bergantung pada RNase H di dalam nukleus (Gambar 2). Ini mengurangi tingkat RNA sebelum transkrip matang diproduksi, tetapi sifat dan tingkat efek di luar target tidak sepenuhnya dipahami dan mungkin substansial (Sahu et al., 2007). Juga, tidak mungkin untuk menghasilkan garis transgenik yang stabil, yang membatasi analisis pada garis sel atau sistem di mana oligonukleotida dapat disuplai melalui injeksi. Pendekatan lain untuk mengganggu fungsi lncRNA menggunakan penargetan morpholino antisense oligos mis. situs sambatan (Ulitsky et al., 2011), atau oligonukleotida antisense asam nukleat terkunci (Sarma et al., 2010).

Perkembangan terbaru dalam desain rasional faktor pengikatan DNA menggunakan protein transkripsi activator-like effector (TALE) atau sistem pengulangan palindromik yang diselingi secara teratur (CRISPR) telah memungkinkan perekrutan aktivasi transkripsi (Cheng et al., 2013) atau domain represi (Cong et al., 2013). al., 2012 Gilbert et al., 2013) ke situs yang ditentukan dalam genom untuk memodulasi transkripsi, atau untuk secara langsung mengganggu jalannya RNA polimerase. Teknik-teknik ini dapat digunakan untuk memodulasi laju inisiasi transkripsi atau pemanjangan lncRNA (Gambar 2), tetapi perhatian harus diberikan untuk mengontrol efek langsung dari faktor-faktor ini pada transkripsi gen tetangga.

Memisahkan RNA- dari efek yang bergantung pada urutan DNA

Penghapusan lokus genomik lncRNA tidak secara jelas memisahkan peran lncRNA itu sendiri dari peran elemen fungsional lain yang terkandung dalam DNA yang mendasarinya. Elemen tersebut mungkin tidak relevan dengan fungsi lncRNA, namun penting untuk fungsi normal dari gen penyandi protein tetangga. Delapan belas garis knockout tikus baru-baru ini dijelaskan di mana daerah genom yang mengandung lokus lncRNA intergenik (ukuran rata-rata 21,6 kb, kisaran 4,8 kb–49,7 kb) dihapus dan diganti dengan lacZ kaset reporter (Sauvageau et al., 2013). Untuk 13 galur ini tidak ada fenotipe yang dilaporkan. Sebaliknya, fenotipe kuat dari 5 garis knockout diamati: Bahaya −/− atau Fendrr −/− tikus telah mengurangi viabilitas Mdgt −/− dan linc-Pint −/− tikus menunjukkan cacat pertumbuhan dan linc-Brn1b −/− tikus menunjukkan anatomi kortikal abnormal. Para penulis menyimpulkan bahwa gangguan perkembangan yang dihasilkan oleh penghapusan DNA ini menunjukkan peran penting yang dimainkan lncRNA in vivo (Sauvageau et al., 2013).

Meskipun ini mungkin interpretasi yang benar, fenotipe kuat yang diamati pada garis-garis ini mungkin berasal dari penghapusan rekayasa dari cis-elemen DNA pengatur terletak di dalam delesi DNA besar yang penting untuk fungsi normal gen penyandi protein proksimal. Contohnya Fendrr adalah 1,4 kb dari Foxf1, dan Mdgt dimulai hanya 84 bp dari 5′ ekson Hoxd1 dan berakhir dekat dengan Hoxd3 (Gambar 3). Konsisten dengan gagasan ini, data dari proyek ENCODE menunjukkan bahwa wilayah genomik dihapus di Mdgt −/− garis mengandung situs pengikatan untuk beberapa faktor transkripsi dan protein pengatur kromatin (Gambar 3). Sementara para penulis mendeteksi tidak ada perubahan global dari ekspresi gen pengkode protein tetangga yang dinilai oleh RNAseq jaringan yang terbatas, masih mungkin bahwa jenis sel yang diubah atau ekspresi spesifik tahap perkembangan dari gen-gen ini lolos dari deteksi. LncRNA sering ditranskripsi dalam populasi sel yang sangat terbatas dan analisis global, throughput tinggi bahkan embrio penuh mungkin tidak informatif. Pada akhirnya, bukti terbaik untuk fungsi lncRNA yang bergantung pada RNA berasal dari hilangnya fungsi, diikuti oleh pendekatan komplementasi, seperti yang dijelaskan dalam Grote et al. (2013).

Data ENCODE manusia dan tikus menunjukkan bahwa Mdgt −/− garis mengandung penghapusan situs pengikatan yang dilestarikan untuk faktor transkripsi dan protein pengatur kromatin.

Penghapusan yang direkayasa pada mouse, dan urutan yang setara pada manusia, ditunjukkan oleh persegi panjang merah, dan mencakup 85% (12,4 kb dari 14,7 kb) urutan intergenik antara mouse Hoxd1 dan Hoxd3. Mdgt, hampir membagikan situs awalnya dengan Hoxd1, sebuah gen yang diekspresikan dengan spesifisitas yang sangat baik hanya dalam beberapa populasi sel selama perkembangan awal (Zakany et al., 2001). Situs pengikatan faktor transkripsi yang diprediksi (TFBs) yang dilestarikan pada manusia, tikus dan tikus ditampilkan terhadap genom manusia (Konsorsium, 2012 Ernst dan Kellis, 2012). Jumlah TFB yang ditentukan secara eksperimental per interval genom ditampilkan dalam histogram, dan kelompok situs hipersensitivitas DNase 1, juga ditampilkan selaras dengan lokus manusia. Pulau CpG yang diprediksi diperoleh dari UCSC Genome Browser ditampilkan dalam warna hijau, dan keberpihakan mouse-manusia yang dirantai ditampilkan dalam warna hijau zaitun. Skor konservasi evolusioner (GERP) ditunjukkan di bawah lokus tikus.

Masalah ini juga relevan untuk lncRNA lain yang ditranskripsi dari dalam hoks cluster gen. Dalam kasus Udara panas (Rinn et al., 2007), penghapusan besar beberapa kb dari keseluruhan Udara panas DNA genomik in vivo menginduksi fenotipe morfologis halus di tulang belakang, yang ditafsirkan sebagai keuntungan fungsi Hoxd gen dalam trans (Li et al., 2013). Namun, Udara panas tertanam di HoxC kluster gen dan modifikasi topologi atau pengaturan ulang dalam rangkaian unit transkripsi yang sedemikian padat cenderung memodifikasi ekspresi gen tetangga. Wawasan lebih lanjut telah diperoleh dengan menghapus seluruh HoxC lokus, termasuk lokus lncRNA dan gen mengapit (Suemori dan Noguchi, 2000 Schorderet dan Duboule, 2011). Bahkan ketika banyak alel tersedia, seperti untuk Udara panas, fungsi lncRNA tetap sulit untuk dievaluasi.

Kekhususan ekspresi dan deret alel

Penghapusan mouse Udara panas lncRNA juga menginduksi fenotipe perkembangan halus di pergelangan tangan (Li et al., 2013). Namun, karena murine Udara panas transkrip tidak terdeteksi dalam mengembangkan tunas kaki depan (Schorderet dan Duboule, 2011) masih mungkin bahwa fenotipe ini berkembang dari kurangnya Udara panas RNA selama tahap perkembangan pergelangan tangan selanjutnya. Kemungkinan ini hanya dapat dinilai dengan analisis lebih lanjut dari pola ekspresi lncRNA ini. Pengenalan sistematis kaset reporter ke lncRNA (Sauvageau et al., 2013) dapat membantu memecahkan masalah ini, asalkan perbedaan antara stabilitas pewarnaan reporter dan waktu paruh RNA diingat, khususnya untuk kecil dan populasi sel dinamis (Zakany et al., 2001).

Sedangkan untuk gen penyandi protein, deskripsi lengkap tentang sifat-sifat fungsional yang terkait dengan lncRNA tertentu tidak dapat dicapai dengan menggunakan alel mutan tunggal, oleh karena itu deret alel diperlukan. Seperti yang ditunjukkan di atas, sifat alel yang diperlukan untuk menilai fungsi lncRNA yang diberikan bergantung pada lokasi genomiknya dan spesifisitas ekspresinya selama perkembangan dan dewasa. Ini bisa sangat menantang, seperti yang dicontohkan oleh dua arah Hot Dog dan Kembar hotdog lncRNA: meskipun RNA ini terletak ratusan kb jauhnya dari HoxD kluster gen di tengah gurun gen, situs awal bersama mereka berinteraksi secara fisik dengan Hoxd gen sebagai bagian dari struktur regulasi umum. Dalam hal ini, cis-efek pada prinsipnya dapat dievaluasi dengan memisahkan lokus lncRNA dari HoxD gugus melalui inversi besar dengan breakpoint di antaranya. Namun, ternyata inversi ini secara global mengganggu regulasi HoxD dengan menggantikan peningkat akting jarak jauh bersama dengan lokus lncRNA, membuat interpretasi menjadi sulit (Delpretti et al., 2013).

Perbedaan antara strategi yang berbeda

lncRNA Fendrr telah dipelajari menggunakan dua strategi independen: penghapusan genetik (Sauvageau et al., 2013) dan penyisipan terminator transkripsi (Grote et al., 2013). Sementara kedua penelitian menggambarkan fenotipe yang mematikan, menyoroti pentingnya potensi lncRNA ini dalam pengembangan, hasilnya berbeda. Delesi genetik menghasilkan maturasi paru dan defek diferensiasi mesenkim (Sauvageau et al., 2013), sedangkan penyisipan terminator menyebabkan defek jantung dan dinding tubuh dan berpengaruh pada ekspresi jaringan tetangga. Foxf1 gen (Grote et al., 2013). Yang penting, cacat yang disebabkan oleh penyisipan terminator diselamatkan oleh transgen yang mengandung satu salinan tipe liar dari Fendrr lokus lncRNA (tanpa fungsionalnya Foxf1 tetangga) ini sangat berimplikasi penghapusan produk RNA, daripada DNA genomiknya, karena menyebabkan fenotipe yang diamati (Grote et al., 2013). Eksperimen penyelamatan transgen dengan demikian penting untuk membangun fungsi lncRNA yang bergantung pada RNA. Ilustrasi sukses sebelumnya dari prinsip ini adalah penyelamatan cacat perkembangan pada ikan zebra dengan injeksi bersama RNA yang disambung untuk masing-masing dari dua lncRNA, cyrano dan megamind, yang RNA prekursornya telah dirobohkan menggunakan morpholino antisense oligos (Ulitsky et al., 2011). Namun, urutan pengaturan yang diperlukan untuk transkripsi lncRNA itu sendiri idealnya harus dimasukkan dalam konstruksi penyelamatan untuk mempertahankan tingkat ekspresi fisiologis. Ini, ditambah dengan panjang lncRNA yang kadang-kadang bisa mencapai beberapa ratus kb, mungkin merupakan tantangan untuk pendekatan transgenik.

Perbedaan substansial juga telah diamati antara knockdown yang dimediasi RNAi dan penyisipan terminator transkripsi di Evf-2 lokus lncRNA (Feng et al., 2006 Bond et al., 2009 Berghoff et al., 2013 Kohtz, 2014). lncRNA ini ditranskripsikan melintasi elemen penambah antara Dlx5 dan Dlx6 gen, dan studi awal dalam kultur sel menggunakan RNAi menyarankan model dimana Evf-2 penting untuk aktivasi Dlx5/6 (Feng et al., 2006). Namun, penyisipan terminator transkripsi pada tikus telah menunjukkan efek sebaliknya pada ekspresi Dlx5/6 (Bond et al., 2009) dan menyebabkan perubahan spesifik pada metilasi DNA pada enhancer. Yang penting perubahan ini dapat diselamatkan oleh Evf-2 ekspresi dari transgen terpisah, menyiratkan bahwa mereka bergantung pada lncRNA itu sendiri (Berghoff et al., 2013).

Sama halnya dengan contoh ini, knockdown of lincRNA-hal 21 oleh RNAi awalnya menyarankan a transmekanisme kerja, di mana lncRNA terlibat dalam perekrutan kompleks protein menjadi kromatin (Huarte et al., 2010). Namun demikian, penelitian selanjutnya di mana promotor lncRNA telah dihapus atau transkripsinya diblokir oleh oligonukleotida antisense telah menyoroti peran yang berbeda, karena lncRNA ini mengatur yang berdekatan hal 21 gen dalam cis, tanpa memiliki trans-efek akting (Dimitrova et al., 2014). Sementara kedua studi dianalisis oleh RNAseq efek penipisan lncRNA pada ekspresi gen global dalam fibroblas embrionik tikus, dua set gen yang diekspresikan secara berbeda tidak tumpang tindih secara signifikan. Saat menganalisis fungsi lncRNA, penting untuk mempertimbangkan beberapa strategi kehilangan fungsi yang membahas berbagai mekanisme aksi.

Efek pembaur potensial dari teknik yang digunakan untuk memisahkan DNA dari fungsi yang bergantung pada RNA lebih lanjut dicontohkan oleh studi Drosophila bxd lncRNA, yang diekspresikan dari dalam cluster HOX, berdekatan dengan Ultrabitoraks (ubx) gen. Ekspresinya sangat spesifik dan terjadi di wilayah luas embrio yang sama dengan ubx gen, meskipun terutama tidak pernah dalam sel yang sama (Petruk et al., 2006). Studi tentang bxd hilangnya fungsi menggunakan teknik yang berbeda telah menghasilkan interpretasi yang saling bertentangan. Telah lama diketahui bahwa penghapusan kecil dalam lncRNA ini menyebabkan efek dramatis pada ekspresi tetangga ubx gen (Lewis, 1978), menghasilkan transformasi homoeotic. Memang, kombinasi alelik tertentu mampu menghasilkan lalat bersayap empat. Studi yang lebih baru dari penghapusan yang sama menunjukkan bahwa tindakan transkripsi lncRNA ini menekan ubx di dalam cis dengan mengubah ikatan protein pada ubx promotor (Petruk et al., 2006). Sebaliknya, dilaporkan bahwa inversi dari bxd promotor, mendorong transkripsi ke arah yang salah sambil mempertahankan komposisi genom, menghasilkan efek yang sangat kecil pada ubx ekspresi, dan kemudian hanya kemudian dalam pengembangan (Pease et al., 2013). Juga, penghapusan menghapus promotor menginduksi a Cdx-seperti perolehan fungsi dari ubx (Sipos et al., 2007). Jelas, interpretasi yang benar dari eksperimen kehilangan fungsi tersebut, pada lokus yang kompleks seperti itu, memerlukan pertimbangan yang cermat dari faktor-faktor yang berpotensi mengacaukan.

Hasil yang kontras dari eksperimen yang berbeda juga dapat muncul karena keterlibatan lncRNA dalam mekanisme yang berbeda dalam konteks seluler yang berbeda. Misalnya, dalam sel embrionik, transkripsi Airn membungkam yang berdekatan Igf2r gen (Latos et al., 2012), sedangkan dalam jaringan ekstraembrionik ia bertindak lebih jauh dengan merekrut histone methyltransferase G9a ke gen yang dicetak (Nagano et al., 2008).

Akhir dari awal: bidang lncRNA yang matang

Studi tentang lncRNA masih dalam tahap awal, dan teknik biokimia dan genetik yang digunakan untuk mengatasi signifikansi dan mekanisme kerja kelas RNA ini baru-baru ini dikembangkan atau diadaptasi dari yang digunakan untuk menyelidiki gen penyandi protein. Oleh karena itu, teknik tersebut harus digunakan dengan hati-hati dan dengan kontrol yang sesuai (Brockdorff, 2013 Riley dan Steitz, 2013). Dari contoh yang dijelaskan di atas, jelas bahwa strategi optimal untuk mempelajari hilangnya fungsi lncRNA bergantung pada mekanisme kerjanya, khususnya dalam cis atau trans konfigurasi, dan urutan peraturan hadir dalam lokusnya. Kami menyarankan bahwa pelajaran awal yang dipetik dari lncRNA penekan paradigma, seperti Xist, dan lncRNA yang dicetak seperti Airn atau Kcnq1ot1, harus memandu desain eksperimen pada lncRNA yang lebih baru diidentifikasi. Kami telah mencoba untuk menyaring pelajaran ini ke dalam pertimbangan yang diusulkan dalam Kotak 1. Pengenalan beberapa alel yang akan diperlukan untuk membedah lncRNA in vivo secara memadai akan sangat terbantu oleh kemajuan terbaru dalam rekayasa genom menggunakan nuklease spesifik lokasi perancang seperti CRISPR /Cas9 dan TALEN. Pengenalan sistem kehilangan fungsi akut yang cepat untuk lncRNA, misalnya yang menyisipkan situs ribonuklease spesifik urutan yang nukleasenya berada di bawah kendali yang dapat diinduksi obat, juga akan sangat memudahkan penyelidikan lncRNA.

NS trans fungsi lncRNA dapat diselidiki menggunakan penghapusan lokus, penghapusan promotor, inversi, penghentian transkripsi atau RNAi. Jika memungkinkan, strategi ini harus dikombinasikan dengan eksperimen penyelamatan genetik, di mana lncRNA diekspresikan dari transgen independen yang disisipkan di lokasi yang berbeda dari lokus lncRNA. Strategi ini memisahkan efek yang bergantung pada RNA dari efek yang timbul dari manipulasi DNA yang mendasarinya. Eksperimen penyelamatan menggunakan ekspresi lncRNA dari transgen independen hanya mungkin untuk translncRNA yang bertindak di mana bagian RNA itu sendiri dan bukan tindakan transkripsi sangat penting untuk fungsi.

NS cis fungsi lncRNA dapat diselidiki menggunakan kombinasi beberapa alel, seperti penyisipan terminator transkripsi, penghapusan promotor dan inversi. Beberapa alel kemungkinan diperlukan untuk memisahkan ketergantungan lncRNA dari efek lain dan, sebagai kontrol, untuk mengungkapkan artefak rekayasa genetika. Inversi yang direkayasa juga dapat digunakan untuk memisahkan lokus lncRNA dari gen target tetangga potensialnya untuk menyelidiki perannya dalam cis. Penggunaan rekombinasi khusus situs, seperti sistem phiC31/attP (Bateman et al., 2006 Zhu et al., 2014) sebagai 'situs pendaratan' atau untuk pertukaran kaset yang dimediasi rekombinasi, akan sangat meningkatkan kemampuan kita untuk menghasilkan seri alelik seperti itu. . Misalnya, lokus lncRNA dapat dihapus dan diganti dengan 'situs pendaratan' rekombinasi di mana konstruksi yang berbeda dapat diperkenalkan untuk menyelidiki penyelamatan fenotipe.

Singkatnya, jika ahli biologi lncRNA ingin menyelesaikan fungsi in vivo yang sebenarnya dari banyak transkrip yang penuh teka-teki ini, maka kekuatan dan kelemahan teknik yang tersedia perlu diakui. Resolusi tidak diragukan lagi akan berasal dari diseksi genetik yang cermat dan komprehensif dari lokus individu menggunakan banyak alel. Bidang biologi lncRNA akan sangat diuntungkan dari pengembangan pendekatan tambahan yang efektif dalam membedakan efek yang dimediasi oleh lncRNA sebagai spesies molekuler dari efeknya pada elemen pengatur gen yang dengannya lokus lncRNA disisipkan di seluruh genom mamalia.


Tonton videonya: ՍՊԻՏԱԿՈՒՑԻ ԿԵՆՍԱՍԻՆԹԵԶ. Protein synthesis (Agustus 2022).