Informasi

20.4: Enzyme Immunoassays (EIA) dan Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) - Biologi

20.4: Enzyme Immunoassays (EIA) dan Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) - Biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tujuan pembelajaran

  • Jelaskan perbedaan dan persamaan antara EIA, FEIA, dan ELISA
  • Jelaskan perbedaan dan persamaan antara imunohistokimia dan imunositokimia!
  • Jelaskan perbedaan tujuan ELISA langsung dan tidak langsung

Mirip dengan western blot, enzyme immunoassays (EIA) menggunakan antibodi untuk mendeteksi keberadaan antigen. Namun, EIA berbeda dari western blot dalam hal pengujian dilakukan di pelat mikrotiter atau in vivo bukan pada membran penyerap. Ada banyak jenis AMDAL yang berbeda, tetapi semuanya melibatkan molekul antibodi yang wilayah konstannya mengikat enzim, meninggalkan wilayah variabel bebas untuk mengikat antigen spesifiknya. Penambahan substrat untuk enzim memungkinkan antigen untuk divisualisasikan atau dikuantifikasi (Gambar (PageIndex{1})).

Dalam AMDAL, substrat untuk enzim paling sering berupa kromogen, molekul tidak berwarna yang diubah menjadi produk akhir berwarna. Enzim yang paling banyak digunakan adalah alkaline phosphatase dan horseradish peroxidase dimana substrat yang sesuai sudah tersedia. Dalam beberapa AMDAL, substratnya adalah fluorogen, molekul nonfluoresen yang diubah enzim menjadi bentuk fluoresen. AMDAL yang memanfaatkan fluorogen disebut fluorescent enzyme immunoassays (FEIAs). Fluoresensi dapat dideteksi baik dengan mikroskop fluoresensi atau spektrofotometer.

TITER MMR

Vaksin MMR merupakan vaksin kombinasi yang memberikan perlindungan terhadap penyakit campak, gondongan, dan rubella (campak Jerman). Kebanyakan orang menerima vaksin MMR sebagai anak-anak dan dengan demikian memiliki antibodi terhadap penyakit ini. Namun, karena berbagai alasan, bahkan individu yang divaksinasi dapat menjadi rentan terhadap penyakit ini lagi di kemudian hari. Misalnya, beberapa anak mungkin hanya menerima satu putaran vaksin MMR, bukan dua yang direkomendasikan. Selain itu, titer antibodi pelindung dalam tubuh individu mungkin mulai menurun seiring bertambahnya usia atau sebagai akibat dari beberapa kondisi medis.

Untuk menentukan apakah titer antibodi dalam aliran darah individu cukup untuk memberikan perlindungan, tes titer MMR dapat dilakukan. Tes ini adalah immunoassay sederhana yang dapat dilakukan dengan cepat dengan sampel darah. Hasil tes akan menunjukkan apakah individu tersebut masih memiliki kekebalan atau membutuhkan dosis vaksin MMR lagi.

Menyerahkan titer MMR seringkali merupakan persyaratan pra-kerja bagi petugas kesehatan, terutama mereka yang akan sering berhubungan dengan anak kecil atau pasien dengan gangguan kekebalan. Jika petugas kesehatan terinfeksi campak, gondok, atau rubella, individu tersebut dapat dengan mudah menularkan penyakit ini kepada pasien yang rentan, yang menyebabkan wabah. Tergantung pada hasil titer MMR, petugas kesehatan mungkin perlu divaksinasi ulang sebelum mulai bekerja.

Imunostaining

Salah satu penggunaan EIA yang kuat adalah immunostaining, di mana konjugat antibodi-enzim meningkatkan mikroskop. Imunohistokimia (IHC) digunakan untuk memeriksa seluruh jaringan. Seperti terlihat pada Gambar (PageIndex{2}), bagian jaringan dapat diwarnai untuk memvisualisasikan berbagai jenis sel. Dalam contoh ini, mAb terhadap CD8 digunakan untuk mewarnai sel CD8 di bagian jaringan amandel. Sekarang dimungkinkan untuk menghitung jumlah sel CD8, menentukan jumlah relatifnya dibandingkan dengan jenis sel lain yang ada, dan menentukan lokasi sel-sel ini di dalam jaringan ini. Data tersebut akan berguna untuk mempelajari penyakit seperti AIDS, di mana fungsi normal sel CD8 sangat penting untuk memperlambat perkembangan penyakit.

Immunocytochemistry (ICC) adalah bentuk imunostaining yang berharga lainnya. Sementara mirip dengan IHC, di ICC, bahan matriks ekstraseluler dilucuti, dan membran sel digores dengan alkohol untuk membuatnya permeabel terhadap antibodi. Hal ini memungkinkan antibodi untuk melewati membran sel dan mengikat target spesifik di dalam sel. Organel, komponen sitoskeletal, dan struktur intraseluler lainnya dapat divisualisasikan dengan cara ini. Sementara beberapa teknik ICC menggunakan EIA, enzim dapat diganti dengan molekul fluoresen, menjadikannya immunoassay fluoresen.

Latihan (PageIndex{1})

  1. Apa perbedaan antara imunohistokimia dan imunositokimia?
  2. Apa yang harus benar dari produk reaksi enzimatik yang digunakan dalam imunohistokimia?

Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs)

Enzym-linked immunosorbent assays (ELISAs) adalah AMDAL yang banyak digunakan. Dalam ELISA langsung, antigen diimobilisasi dalam sumur pelat mikrotiter. Antibodi yang spesifik untuk antigen tertentu dan terkonjugasi ke enzim ditambahkan ke setiap sumur. Jika antigen hadir, maka antibodi akan mengikat. Setelah dicuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat, substrat tidak berwarna (kromogen) ditambahkan. Kehadiran enzim mengubah substrat menjadi produk akhir berwarna (Gambar (PageIndex{1})). Walaupun teknik ini lebih cepat karena hanya memerlukan penggunaan satu antibodi, namun memiliki kelemahan yaitu sinyal dari ELISA langsung lebih rendah (sensitivitas lebih rendah).

Dalam sandwich ELISA, tujuannya adalah untuk menggunakan antibodi untuk secara tepat mengukur antigen spesifik yang ada dalam larutan, seperti antigen dari patogen, protein serum, atau hormon dari darah atau urin. Langkah pertama dari sandwich ELISA adalah menambahkan antibodi primer ke semua lubang pelat mikrotiter (Gambar (PageIndex{3})). Antibodi menempel pada plastik melalui interaksi hidrofobik. Setelah waktu inkubasi yang tepat, antibodi yang tidak terikat akan hilang. Pencucian yang sebanding digunakan di antara setiap langkah berikutnya untuk memastikan bahwa hanya molekul yang terikat secara khusus yang tetap melekat pada pelat. Protein penghambat kemudian ditambahkan (misalnya, albumin atau kasein protein susu) untuk mengikat situs pengikatan protein nonspesifik yang tersisa di dalam sumur. Beberapa sumur akan menerima jumlah antigen yang diketahui untuk memungkinkan konstruksi kurva standar, dan larutan antigen yang tidak diketahui ditambahkan ke sumur lainnya. Antibodi primer menangkap antigen dan, setelah pencucian, antibodi sekunder ditambahkan, yang merupakan antibodi poliklonal yang terkonjugasi dengan enzim. Setelah pencucian terakhir, substrat tidak berwarna (kromogen) ditambahkan, dan enzim mengubahnya menjadi produk akhir berwarna. Intensitas warna sampel yang disebabkan oleh produk akhir diukur dengan spektrofotometer. Jumlah warna yang dihasilkan (diukur sebagai absorbansi) berbanding lurus dengan jumlah enzim, yang pada gilirannya berbanding lurus dengan antigen yang ditangkap. ELISA sangat sensitif, memungkinkan antigen dikuantifikasi dalam nanogram (10–9 g) per kisaran mL.

Dalam ELISA tidak langsung, kami mengukur antibodi spesifik antigen daripada antigen. Kita dapat menggunakan ELISA tidak langsung untuk mendeteksi antibodi terhadap banyak jenis patogen, termasuk Borrelia burgdorferi (penyakit Lyme) dan HIV. Ada tiga perbedaan penting antara ELISA tidak langsung dan langsung seperti yang ditunjukkan pada Gambar (PageIndex{4}). Daripada menggunakan antibodi untuk menangkap antigen, ELISA tidak langsung dimulai dengan menempelkan antigen yang diketahui (misalnya, peptida dari HIV) ke dasar sumur pelat mikrotiter. Setelah memblokir situs yang tidak terikat di piring, serum pasien ditambahkan; jika ada antibodi (antibodi primer), mereka akan mengikat antigen. Setelah membersihkan protein yang tidak terikat, antibodi sekunder dengan enzim terkonjugasinya diarahkan melawan antibodi primer (misalnya, imunoglobulin antihuman). Antibodi sekunder memungkinkan kita untuk mengukur seberapa banyak antibodi spesifik antigen yang ada dalam serum pasien dengan intensitas warna yang dihasilkan dari reaksi enzim-kromogen terkonjugasi.

Seperti beberapa tes lain untuk antibodi yang dibahas dalam bab ini, selalu ada kekhawatiran tentang reaktivitas silang dengan antibodi yang ditujukan terhadap beberapa antigen lain, yang dapat menyebabkan hasil positif palsu. Jadi, kami tidak dapat mendiagnosis infeksi HIV (atau jenis infeksi lainnya) secara pasti berdasarkan uji ELISA tidak langsung tunggal. Kami harus mengkonfirmasi setiap tes positif yang dicurigai, yang paling sering dilakukan dengan menggunakan imunoblot yang benar-benar mengidentifikasi keberadaan peptida spesifik dari patogen atau tes untuk mengidentifikasi asam nukleat yang terkait dengan patogen, seperti reverse transcriptase PCR (RT-PCR). ) atau tes antigen asam nukleat.

Latihan (PageIndex{2})

  1. Apa tujuan antibodi sekunder dalam ELISA langsung?
  2. Apa yang diukur ELISA langsung dan tidak langsung?

fokus klinis - bagian 2

Meskipun menghubungi dan menguji 1300 pasien HIV akan memakan waktu dan mahal, administrator berharap untuk meminimalkan tanggung jawab rumah sakit dengan secara proaktif mencari dan merawat calon korban kejahatan karyawan nakal. Deteksi dini HIV adalah penting, dan pengobatan yang cepat dapat memperlambat perkembangan penyakit.

Ada berbagai tes skrining untuk HIV, tetapi yang paling banyak digunakan adalah ELISA tidak langsung. Seperti ELISA tidak langsung lainnya, tes ini bekerja dengan menempelkan antigen (dalam hal ini, peptida HIV) ke sebuah sumur di pelat 96-sumur. Jika pasien HIV positif, antibodi anti-HIV akan mengikat antigen dan diidentifikasi oleh konjugat antibodi-enzim kedua.

Latihan (PageIndex{3})

  1. Seberapa akurat tes ELISA tidak langsung untuk HIV, dan faktor apa yang dapat memengaruhi akurasi tes?
  2. Haruskah rumah sakit menggunakan tes lain untuk mengkonfirmasi hasil ELISA tidak langsung?

Pemeriksaan Imunofiltrasi dan Imunokromatografi

Untuk beberapa situasi, mungkin perlu untuk mendeteksi atau mengukur antigen atau antibodi yang ada pada konsentrasi yang sangat rendah dalam larutan. Teknik imunofiltrasi telah dikembangkan untuk memungkinkan hal ini. Dalam imunofiltrasi, sejumlah besar cairan dilewatkan melalui membran berpori ke bantalan penyerap. Antigen yang menempel pada membran berpori akan menangkap antibodi saat lewat; sebagai alternatif, kita juga dapat menempelkan antibodi ke membran untuk menangkap antigen.

Metode imunofiltrasi telah diadaptasi dalam pengembangan uji imunokromatografi, umumnya dikenal sebagai uji aliran lateral atau uji strip. Tes ini cepat dan mudah dilakukan, membuatnya populer untuk penggunaan di tempat perawatan (yaitu, di kantor dokter) atau digunakan di rumah. Salah satu contohnya adalah tes TORCH yang memungkinkan dokter untuk menyaring wanita hamil atau bayi baru lahir untuk infeksi oleh berbagai virus dan patogen lainnya (Toksoplasma, virus lain, rubella, cytomegalovirus, herpes simpleks). Tes kehamilan di rumah adalah contoh lain yang banyak digunakan dari tes aliran lateral (Gambar (PageIndex{5})). Tes imunofiltrasi juga populer di negara berkembang, karena murah dan tidak memerlukan pendinginan konstan reagen kering. Namun, teknologi tersebut juga dibangun ke dalam beberapa peralatan laboratorium yang canggih.

Dalam tes aliran lateral (Gambar (PageIndex{6})), cairan seperti urin diterapkan ke bantalan penyerap pada strip tes. Cairan mengalir dengan aksi kapiler dan bergerak melalui garis manik-manik dengan antibodi yang melekat pada permukaannya. Cairan dalam sampel sebenarnya menghidrasi reagen, yang ada dalam keadaan kering di strip. Manik-manik berlapis antibodi yang terbuat dari lateks atau partikel emas kecil akan mengikat antigen dalam cairan uji. Kompleks antibodi-antigen kemudian mengalir melalui jalur kedua yang telah melumpuhkan antibodi terhadap antigen; strip ini akan mempertahankan manik-manik yang memiliki antigen terikat. Garis kontrol ketiga mengikat manik-manik apa pun. Warna merah (dari partikel emas) atau biru (dari manik-manik lateks) yang berkembang di garis uji menunjukkan tes positif. Jika warna hanya berkembang pada garis kontrol, tesnya negatif.

Seperti teknik ELISA, tes aliran lateral memanfaatkan sandwich antibodi, memberikan sensitivitas dan spesifisitas. Meskipun tidak sekuantitatif ELISA, tes ini memiliki keuntungan karena cepat, murah, dan tidak bergantung pada peralatan khusus. Dengan demikian, mereka dapat dilakukan di mana saja oleh siapa saja. Ada beberapa kekhawatiran tentang menempatkan tes diagnostik yang begitu kuat ke tangan orang-orang yang mungkin tidak memahami keterbatasan tes, seperti kemungkinan hasil positif palsu. Sementara tes kehamilan di rumah telah diterima secara luas, tes deteksi antibodi di rumah untuk penyakit seperti HIV telah menimbulkan beberapa kekhawatiran di komunitas medis. Beberapa orang mempertanyakan apakah tes semacam itu boleh dilakukan sendiri tanpa adanya tenaga medis yang dapat menjelaskan hasil tes dan memesan tes konfirmasi yang sesuai. Namun, dengan semakin banyaknya tes aliran lateral yang tersedia, dan perkembangan pesat teknologi lab-on-a-chip ([link]), tes medis di rumah kemungkinan akan menjadi lebih umum di masa depan.

Latihan (PageIndex{4})

  1. Proses fisik apa yang dibutuhkan metode aliran lateral untuk berfungsi?
  2. Jelaskan tujuan dari strip ketiga dalam uji aliran lateral.

Tabel (PageIndex{1}) membandingkan beberapa mekanisme kunci dan contoh beberapa AMDAL yang dibahas dalam bagian ini serta imunoblot, yang dibahas dalam Mendeteksi Kompleks Antigen-Antibodi.

Tabel (PageIndex{1}): Immunoblots & Enzyme Immunoassays
Jenis PengujianMekanismeProsedur KhususContoh
ImunoblotMenggunakan konjugat enzim-antibodi untuk mengidentifikasi protein spesifik yang telah ditransfer ke membran penyerapWestern blot: Mendeteksi keberadaan protein tertentuMendeteksi keberadaan peptida HIV (atau peptida dari agen infeksi lain) dalam serum pasien
ImunostainingMenggunakan konjugat enzim-antibodi untuk menodai molekul tertentu pada atau di dalam selImunohistokimia: Digunakan untuk mewarnai sel-sel tertentu dalam jaringanPewarnaan untuk keberadaan sel CD8 di jaringan inang
Uji imunosorben terkait-enzim (ELISA)Menggunakan konjugat enzim-antibodi untuk mengukur molekul targetELISA langsung: Menggunakan antibodi tunggal untuk mendeteksi keberadaan antigenDeteksi antigen HIV p24 hingga satu bulan setelah terinfeksi
ELISA tidak langsung: Mengukur jumlah antibodi yang diproduksi terhadap antigenDeteksi antibodi HIV dalam serum
Tes imunokromatografi (aliran lateral)Teknik menggunakan penangkapan kompleks antigen-antibodi berlabel warna yang mengalir oleh antibodi tetap untuk diagnosis penyakitSandwich ELISA: Mengukur jumlah antigen yang terikat oleh antibodiDeteksi antibodi untuk berbagai patogen dalam serum pasien (misalnya, strep cepat, dipstick malaria)
Tes kehamilan mendeteksi human chorionic gonadotrophin dalam urin

fokus klinis - bagian 3

Meskipun ELISA tidak langsung untuk HIV adalah tes yang sensitif, ada beberapa pertimbangan yang rumit. Pertama, jika orang yang terinfeksi dites terlalu cepat setelah terinfeksi, tes tersebut dapat memberikan hasil negatif palsu. Jendela serokonversi umumnya sekitar tiga minggu, tetapi dalam beberapa kasus, bisa lebih dari dua bulan.

Selain negatif palsu, positif palsu juga dapat terjadi, biasanya karena infeksi sebelumnya dengan virus lain yang menginduksi antibodi yang bereaksi silang. Tingkat positif palsu tergantung pada merek tes tertentu yang digunakan, tetapi 0,5% tidak biasa.1 Karena kemungkinan positif palsu, semua tes positif ditindaklanjuti dengan tes konfirmasi. Tes konfirmasi ini seringkali merupakan imunoblot (western blot) di mana peptida HIV dari darah pasien diidentifikasi menggunakan konjugat mAb-enzim spesifik HIV. Western blot positif akan mengkonfirmasi infeksi HIV dan blot negatif akan mengkonfirmasi tidak adanya HIV meskipun ELISA positif.

Sayangnya, western blot untuk antigen HIV sering memberikan hasil yang tidak pasti, dalam hal ini, mereka tidak mengkonfirmasi atau membatalkan hasil ELISA tidak langsung. Faktanya, tingkat indeterminan bisa 10–49% (itulah sebabnya, dikombinasikan dengan biayanya, western blot tidak digunakan untuk penyaringan). Mirip dengan ELISA tidak langsung, western blot yang tidak dapat ditentukan dapat terjadi karena reaktivitas silang atau infeksi virus sebelumnya, vaksinasi, atau penyakit autoimun.

Latihan (PageIndex{5})

  1. Dari 1300 pasien yang diuji, berapa banyak tes ELISA positif palsu yang diharapkan?
  2. Dari hasil positif palsu, berapa banyak noda barat tak tentu yang bisa diharapkan?
  3. Bagaimana rumah sakit menangani kasus di mana western blot pasien tidak dapat ditentukan?

Konsep dan Ringkasan Utama

  • Enzim immunoassay (EIA) digunakan untuk memvisualisasikan dan mengukur antigen. Mereka menggunakan antibodi terkonjugasi ke enzim untuk mengikat antigen, dan enzim mengubah substrat menjadi produk akhir yang dapat diamati. Substrat dapat berupa kromogen atau fluorogen.
  • Imunostaining adalah teknik AMDAL untuk memvisualisasikan sel dalam jaringan (imunohistokimia) atau memeriksa struktur intraseluler (imunositokimia).
  • ELISA langsung digunakan untuk mengukur antigen dalam larutan. Antibodi primer menangkap antigen, dan antibodi sekunder memberikan enzim. Produksi produk akhir dari substrat kromogenik berbanding lurus dengan jumlah antigen yang ditangkap.
  • ELISA tidak langsung digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam serum pasien dengan menempelkan antigen ke lubang pelat mikrotiter, memungkinkan antibodi pasien (primer) untuk mengikat antigen dan antibodi sekunder terkonjugasi enzim untuk mendeteksi antibodi primer.
  • Tes imunofiltrasi dan imunokromatografi digunakan dalam tes aliran lateral, yang dapat digunakan untuk mendiagnosis kehamilan dan berbagai penyakit dengan mendeteksi kompleks antigen-antibodi berlabel warna dalam urin atau sampel cairan lainnya

Pilihan ganda

Dalam immunoassay enzim, enzim

A. terikat oleh situs pengikatan antigen antibodi.
B. melekat pada sumur pelat mikrotiter.
C. terkonjugasi dengan antigen tersangka.
D. terikat pada daerah konstan antibodi sekunder.

D

Saat menggunakan EIA untuk mempelajari mikrotubulus atau struktur lain di dalam sel, pertama-tama kita memperbaiki sel secara kimiawi dan kemudian memperlakukan sel dengan alkohol. Apa tujuan dari perawatan alkohol ini?

A. Itu membuat lubang di membran sel cukup besar untuk dilewati antibodi.
B. Itu membuat membran lengket sehingga antibodi akan mengikat dan diambil oleh endositosis yang dimediasi reseptor.
C. Ini menghilangkan muatan negatif dari membran, yang sebaliknya akan menolak antibodi.
D. Mencegah pengikatan nonspesifik antibodi ke membran sel.

A

Dalam tes kehamilan aliran lateral, Anda melihat bentuk pita biru pada garis kontrol dan tidak ada bentuk pita pada garis uji. Ini mungkin tes ________ untuk kehamilan.

A. positif
B. positif palsu
C. negatif palsu
D. negatif

D

Saat melakukan FEIA, fluorogen menggantikan ________ yang digunakan dalam AMDAL.

A. antigen
B. substrat kromogenik
C.enzim
D.antibodi sekunder

B

Isi bagian yang kosong

Untuk mendeteksi antibodi terhadap bakteri dalam aliran darah menggunakan EIA, kita akan menjalankan a(n) ________, yang akan kita mulai dengan menempelkan antigen dari bakteri ke lubang pelat mikrotiter.

ELISA tidak langsung

Jawaban singkat

Mengapa penting dalam ELISA sandwich bahwa antigen memiliki banyak epitop? Dan mengapa mungkin lebih menguntungkan menggunakan antiserum poliklonal daripada mAb dalam pengujian ini?

Strip tes kehamilan mendeteksi adanya human chorionic gonadotrophin dalam urin. Hormon ini awalnya diproduksi oleh janin dan kemudian oleh plasenta. Mengapa strip tes lebih disukai untuk tes ini daripada menggunakan ELISA langsung atau tidak langsung dengan hasil yang lebih terukur?

Berpikir kritis

Beri label pada antibodi primer dan sekunder, dan diskusikan mengapa produksi produk akhir akan sebanding dengan jumlah antigen.

Catatan kaki

  1. 1 Thomas, Justin G., Victor Jaffe, Judith Shaffer, dan Jose Abreu, “Pengujian HIV: Rekomendasi AS 2014,” Dokter Keluarga Osteopatik 6, tidak. 6 (2014).

Diagnosis Laboratorium Penyakit Virus

FRANK FENNER, . DAVID O. WHITE , dalam Virologi Kedokteran Hewan , 1987

Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)

ELISA (juga dikenal sebagai enzyme immunoassay , EIA) menawarkan sensitivitas yang sama seperti radioimmunoassay tanpa kelemahan yang melekat pada isotop mahal dengan waktu paruh pendek dan kebutuhan untuk penanganan dan pembuangan yang aman dan penghitung gamma yang mahal. Prinsip dasarnya mirip dengan radioimmunoassay (Gbr. 13-3). Antibodi terikat pada fase padat, biasanya sumur baki mikrotiter. Sampel yang diduga mengandung antigen ditambahkan ke dalam sumur. Setelah waktu reaksi yang tepat, sumur dibilas dan antibodi spesifik virus kedua yang telah terkonjugasi ke enzim ditambahkan. Setelah memungkinkan untuk mengikat, isi sumur dibilas dan substrat untuk enzim ditambahkan. Pemeriksaan dibaca dengan perubahan warna pada substrat dan dapat dibuat kuantitatif dengan pengenceran antigen secara serial untuk mendapatkan titik akhir atau dengan membaca fotometrik jumlah perubahan warna, yang mencerminkan jumlah antibodi terkonjugasi enzim yang terikat. Seperti dalam radioimmunoassay, ada banyak variasi dalam protokol, misalnya, memanfaatkan afinitas avidin yang sangat tinggi untuk biotin (Gbr. 13-3, kanan). Selain itu, jika antigen terikat pada pelat terlebih dahulu, prosedur ini sama cocoknya untuk deteksi dan kuantisasi antibodi virus.

ARA. 13-3 . Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mendeteksi virus dan/atau antigen virus. Kiri, langsung. Benar, avidin-biotin.

Prosedur ELISA telah dikembangkan untuk berbagai aplikasi dalam kedokteran hewan. Pada satu tingkat, kit telah dipasarkan untuk diagnosis cepat sejumlah penyakit virus penting oleh praktisi veteriner sendiri. Di tingkat lain, prosedur ELISA telah diotomatisasi dengan pengenalan alat pengeluaran, pencucian, dan pembacaan spektrofotometri dan perekaman otomatis, yang memungkinkan ratusan sampel untuk diproses dalam sehari, misalnya, dalam pengujian babi untuk antibodi pseudorabies.


20.4 AMDAL dan ELISA

Mirip dengan western blot, enzyme immunoassays (EIAs) menggunakan antibodi untuk mendeteksi keberadaan antigen. Namun, EIA berbeda dari western blot dalam hal pengujian dilakukan di pelat mikrotiter atau in vivo bukan pada membran penyerap. Ada banyak jenis AMDAL yang berbeda, tetapi semuanya melibatkan molekul antibodi yang daerah konstannya mengikat enzim, meninggalkan daerah variabel bebas untuk mengikat antigen spesifiknya. Penambahan substrat untuk enzim memungkinkan antigen untuk divisualisasikan atau dikuantifikasi (Gambar 20.22).

Dalam AMDAL, substrat untuk enzim paling sering berupa kromogen, molekul tidak berwarna yang diubah menjadi produk akhir berwarna. Enzim yang paling banyak digunakan adalah alkaline phosphatase dan horseradish peroxidase dimana substrat yang sesuai sudah tersedia. Dalam beberapa AMDAL, substratnya adalah fluorogen, molekul nonfluoresen yang diubah oleh enzim menjadi bentuk fluoresen. AMDAL yang memanfaatkan fluorogen disebut fluorescent enzyme immunoassays (FEIAs). Fluoresensi dapat dideteksi baik dengan mikroskop fluoresensi atau spektrofotometer.

Koneksi Mikro

Titer MMR

Vaksin MMR merupakan vaksin kombinasi yang memberikan perlindungan terhadap penyakit campak, gondongan, dan rubella (campak Jerman). Kebanyakan orang menerima vaksin MMR sebagai anak-anak dan dengan demikian memiliki antibodi terhadap penyakit ini. Namun, karena berbagai alasan, bahkan individu yang divaksinasi dapat menjadi rentan terhadap penyakit ini lagi di kemudian hari. Misalnya, beberapa anak mungkin hanya menerima satu putaran vaksin MMR, bukan dua yang direkomendasikan. Selain itu, titer antibodi pelindung dalam tubuh individu mungkin mulai menurun seiring bertambahnya usia atau sebagai akibat dari beberapa kondisi medis.

Untuk menentukan apakah titer antibodi dalam aliran darah individu cukup untuk memberikan perlindungan, tes titer MMR dapat dilakukan. Tes ini adalah immunoassay sederhana yang dapat dilakukan dengan cepat dengan sampel darah. Hasil tes akan menunjukkan apakah individu tersebut masih memiliki kekebalan atau membutuhkan dosis vaksin MMR lagi.

Menyerahkan titer MMR seringkali merupakan persyaratan pra-kerja bagi petugas kesehatan, terutama mereka yang akan sering berhubungan dengan anak kecil atau pasien dengan gangguan kekebalan. Jika petugas kesehatan terinfeksi campak, gondok, atau rubella, individu tersebut dapat dengan mudah menularkan penyakit ini kepada pasien yang rentan, yang menyebabkan wabah. Tergantung pada hasil titer MMR, petugas kesehatan mungkin perlu divaksinasi ulang sebelum mulai bekerja.

Imunostaining

Salah satu penggunaan EIA yang kuat adalah immunostaining, di mana konjugat antibodi-enzim meningkatkan mikroskop. Imunohistokimia (IHC) digunakan untuk memeriksa seluruh jaringan. Seperti terlihat pada Gambar 20.23, bagian jaringan dapat diwarnai untuk memvisualisasikan berbagai jenis sel. Dalam contoh ini, mAb terhadap CD8 digunakan untuk mewarnai sel CD8 di bagian jaringan amandel. Sekarang dimungkinkan untuk menghitung jumlah sel CD8, menentukan jumlah relatifnya dibandingkan dengan jenis sel lain yang ada, dan menentukan lokasi sel-sel ini di dalam jaringan ini. Data tersebut akan berguna untuk mempelajari penyakit seperti AIDS, di mana fungsi normal sel CD8 sangat penting untuk memperlambat perkembangan penyakit.

Immunocytochemistry (ICC) adalah bentuk imunostaining yang berharga lainnya. Sementara mirip dengan IHC, di ICC, bahan matriks ekstraseluler dilucuti, dan membran sel digores dengan alkohol untuk membuatnya permeabel terhadap antibodi. Hal ini memungkinkan antibodi untuk melewati membran sel dan mengikat target spesifik di dalam sel. Organel, komponen sitoskeletal, dan struktur intraseluler lainnya dapat divisualisasikan dengan cara ini. Sementara beberapa teknik ICC menggunakan EIA, enzim dapat diganti dengan molekul fluoresen, menjadikannya immunoassay fluoresen.

Periksa Pemahaman Anda

  • Apa perbedaan antara imunohistokimia dan imunositokimia?
  • Apa yang harus benar dari produk reaksi enzimatik yang digunakan dalam imunohistokimia?

Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs)

Enzym-linked immunosorbent assays (ELISAs) adalah AMDAL yang banyak digunakan. Dalam ELISA langsung, antigen diimobilisasi dalam sumur pelat mikrotiter. Antibodi yang spesifik untuk antigen tertentu dan terkonjugasi dengan enzim ditambahkan ke setiap sumur. Jika antigen hadir, maka antibodi akan mengikat. Setelah dicuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat, substrat tidak berwarna ( chromogen ) ditambahkan. Kehadiran enzim mengubah substrat menjadi produk akhir berwarna (Gambar 20.22). Walaupun teknik ini lebih cepat karena hanya memerlukan penggunaan satu antibodi, namun memiliki kelemahan yaitu sinyal dari ELISA langsung lebih rendah (sensitivitas lebih rendah).

Dalam sandwich ELISA , tujuannya adalah menggunakan antibodi untuk secara tepat mengukur antigen spesifik yang ada dalam larutan, seperti antigen dari patogen, protein serum, atau hormon dari darah atau urin. Langkah pertama dari sandwich ELISA adalah menambahkan antibodi primer ke semua lubang pelat mikrotiter (Gambar 20.24). Antibodi menempel pada plastik melalui interaksi hidrofobik. Setelah waktu inkubasi yang tepat, antibodi yang tidak terikat akan hilang. Pencucian yang sebanding digunakan di antara setiap langkah berikutnya untuk memastikan bahwa hanya molekul yang terikat secara khusus yang tetap melekat pada pelat. Protein penghambat kemudian ditambahkan (misalnya, albumin atau kasein protein susu) untuk mengikat situs pengikatan protein nonspesifik yang tersisa di dalam sumur. Beberapa sumur akan menerima jumlah antigen yang diketahui untuk memungkinkan konstruksi kurva standar, dan larutan antigen yang tidak diketahui ditambahkan ke sumur lainnya. Antibodi primer menangkap antigen dan, setelah pencucian, antibodi sekunder ditambahkan, yang merupakan antibodi poliklonal yang terkonjugasi dengan enzim. Setelah pencucian terakhir, substrat tidak berwarna (kromogen) ditambahkan, dan enzim mengubahnya menjadi produk akhir berwarna. Intensitas warna sampel yang disebabkan oleh produk akhir diukur dengan spektrofotometer. Jumlah warna yang dihasilkan (diukur sebagai absorbansi) berbanding lurus dengan jumlah enzim, yang pada gilirannya berbanding lurus dengan antigen yang ditangkap. ELISA sangat sensitif, memungkinkan antigen dikuantifikasi dalam rentang nanogram (10 -9 g) per mL.

Dalam ELISA tidak langsung, kami mengukur antibodi spesifik antigen daripada antigen. Kita dapat menggunakan ELISA tidak langsung untuk mendeteksi antibodi terhadap banyak jenis patogen, termasuk Borrelia burgdorferi (penyakit Lyme) dan HIV. Ada tiga perbedaan penting antara ELISA tidak langsung dan langsung seperti yang ditunjukkan pada Gambar 20.25. Daripada menggunakan antibodi untuk menangkap antigen, ELISA tidak langsung dimulai dengan menempelkan antigen yang diketahui (misalnya, peptida dari HIV) ke dasar sumur pelat mikrotiter. Setelah memblokir situs yang tidak terikat di piring, serum pasien ditambahkan jika ada antibodi (antibodi primer), mereka akan mengikat antigen. Setelah membersihkan protein yang tidak terikat, antibodi sekunder dengan enzim terkonjugasinya diarahkan melawan antibodi primer (misalnya, imunoglobulin antihuman). Antibodi sekunder memungkinkan kita untuk mengukur seberapa banyak antibodi spesifik antigen yang ada dalam serum pasien dengan intensitas warna yang dihasilkan dari reaksi enzim-kromogen terkonjugasi.

Seperti beberapa tes lain untuk antibodi yang dibahas dalam bab ini, selalu ada kekhawatiran tentang reaktivitas silang dengan antibodi yang ditujukan terhadap beberapa antigen lain, yang dapat menyebabkan hasil positif palsu. Jadi, kami tidak dapat mendiagnosis infeksi HIV (atau jenis infeksi lainnya) secara pasti berdasarkan uji ELISA tidak langsung tunggal. Kami harus mengkonfirmasi setiap tes positif yang dicurigai, yang paling sering dilakukan dengan menggunakan imunoblot yang benar-benar mengidentifikasi keberadaan peptida spesifik dari patogen atau tes untuk mengidentifikasi asam nukleat yang terkait dengan patogen, seperti reverse transcriptase PCR (RT-PCR). ) atau tes antigen asam nukleat.

Periksa Pemahaman Anda

  • Apa tujuan antibodi sekunder dalam ELISA langsung?
  • Apa yang diukur ELISA langsung dan tidak langsung?

Fokus Klinis

Bagian 2

Meskipun menghubungi dan menguji 1300 pasien HIV akan memakan waktu dan mahal, administrator berharap untuk meminimalkan tanggung jawab rumah sakit dengan secara proaktif mencari dan merawat calon korban kejahatan karyawan nakal. Deteksi dini HIV adalah penting, dan pengobatan yang cepat dapat memperlambat perkembangan penyakit.

Ada berbagai tes skrining untuk HIV, tetapi yang paling banyak digunakan adalah ELISA tidak langsung. Seperti ELISA tidak langsung lainnya, tes ini bekerja dengan menempelkan antigen (dalam hal ini, peptida HIV) ke sebuah sumur di pelat 96-sumur. Jika pasien HIV positif, antibodi anti-HIV akan mengikat antigen dan diidentifikasi oleh konjugat antibodi-enzim kedua.

  • Seberapa akurat tes ELISA tidak langsung untuk HIV, dan faktor apa yang dapat memengaruhi akurasi tes?
  • Haruskah rumah sakit menggunakan tes lain untuk mengkonfirmasi hasil ELISA tidak langsung?

Lompat ke kotak Fokus Klinis sebelumnya. Lompat ke kotak Fokus Klinis berikutnya.

Pemeriksaan Imunofiltrasi dan Imunokromatografi

Untuk beberapa situasi, mungkin perlu untuk mendeteksi atau mengukur antigen atau antibodi yang ada pada konsentrasi yang sangat rendah dalam larutan. Immunofiltration techniques have been developed to make this possible. In immunofiltration , a large volume of fluid is passed through a porous membrane into an absorbent pad. An antigen attached to the porous membrane will capture antibody as it passes alternatively, we can also attach an antibody to the membrane to capture antigen.

The method of immunofiltration has been adapted in the development of immunochromatographic assays , commonly known as lateral flow tests or strip tests. These tests are quick and easy to perform, making them popular for point-of-care use (i.e., in the doctor’s office) or in-home use. One example is the TORCH test that allows doctors to screen pregnant women or newborns for infection by an array of viruses and other pathogens (Toxoplasma, other viruses, rubella, cytomegalovirus, herpes simplex). In-home pregnancy tests are another widely used example of a lateral flow test (Figure 20.26). Immunofiltration tests are also popular in developing countries, because they are inexpensive and do not require constant refrigeration of the dried reagents. However, the technology is also built into some sophisticated laboratory equipment.

In lateral flow tests (Figure 20.27), fluids such as urine are applied to an absorbent pad on the test strip. The fluid flows by capillary action and moves through a stripe of beads with antibodies attached to their surfaces. The fluid in the sample actually hydrates the reagents, which are present in a dried state in the stripe. Antibody-coated beads made of latex or tiny gold particles will bind antigens in the test fluid. The antibody-antigen complexes then flow over a second stripe that has immobilized antibody against the antigen this stripe will retain the beads that have bound antigen. A third control stripe binds any beads. A red color (from gold particles) or blue (from latex beads) developing at the test line indicates a positive test. If the color only develops at the control line, the test is negative.

Like ELISA techniques, lateral flow tests take advantage of antibody sandwiches, providing sensitivity and specificity. While not as quantitative as ELISA, these tests have the advantage of being fast, inexpensive, and not dependent on special equipment. Thus, they can be performed anywhere by anyone. There are some concerns about putting such powerful diagnostic tests into the hands of people who may not understand the tests’ limitations, such as the possibility of false-positive results. While home pregnancy tests have become widely accepted, at-home antibody-detection tests for diseases like HIV have raised some concerns in the medical community. Some have questioned whether self-administration of such tests should be allowed in the absence of medical personnel who can explain the test results and order appropriate confirmatory tests. However, with growing numbers of lateral flow tests becoming available, and the rapid development of lab-on-a-chip technology (Figure 20.1), home medical tests are likely to become even more commonplace in the future.

Check Your Understanding

  • What physical process does the lateral flow method require to function?
  • Explain the purpose of the third strip in a lateral flow assay.

Table 20.4 compares some of the key mechanisms and examples of some of the EIAs discussed in this section as well as immunoblots, which were discussed in Detecting Antigen-Antibody Complexes.

Immunoblots & Enzyme Immunoassays
Type of Assay Mekanisme Specific Procedures Contoh
Immunoblots Uses enzyme-antibody conjugates to identify specific proteins that have been transferred to an absorbent membrane Western blot: Detects the presence of a particular protein Detecting the presence of HIV peptides (or peptides from other infectious agents) in patient sera
Immunostaining Uses enzyme-antibody conjugates to stain specific molecules on or in cells Immunohistochemistry: Used to stain specific cells in a tissue Stain for presence of CD8 cells in host tissue
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Uses enzyme-antibody conjugates to quantify target molecules Direct ELISA: Uses a single antibody to detect the presence of an antigen Detection of HIV antigen p24 up to one month after being infected
Indirect ELISA: Measures the amount of antibody produced against an antigen Detection of HIV antibodies in serum
Immunochromatographic (lateral flow) assays Techniques use the capture of flowing, color-labeled antigen-antibody complexes by fixed antibody for disease diagnosis Sandwich ELISA: Measures the amount of antigen bound by the antibody Detection of antibodies for various pathogens in patient sera (e.g., rapid strep, malaria dipstick)
Pregnancy test detecting human chorionic gonadotrophin in urine

Clinical Focus

Part 3

Although the indirect ELISA for HIV is a sensitive assay, there are several complicating considerations. First, if an infected person is tested too soon after becoming infected, the test can yield false-negative results. The seroconversion window is generally about three weeks, but in some cases, it can be more than two months.

In addition to false negatives, false positives can also occur, usually due to previous infections with other viruses that induce cross-reacting antibodies. The false-positive rate depends on the particular brand of test used, but 0.5% is not unusual. 10 Because of the possibility of a false positive, all positive tests are followed up with a confirmatory test. This confirmatory test is often an immunoblot (western blot) in which HIV peptides from the patient’s blood are identified using an HIV-specific mAb-enzyme conjugate. A positive western blot would confirm an HIV infection and a negative blot would confirm the absence of HIV despite the positive ELISA.

Unfortunately, western blots for HIV antigens often yield indeterminant results, in which case, they neither confirm nor invalidate the results of the indirect ELISA. In fact, the rate of indeterminants can be 10–49% (which is why, combined with their cost, western blots are not used for screening). Similar to the indirect ELISA, an indeterminant western blot can occur because of cross-reactivity or previous viral infections, vaccinations, or autoimmune diseases.

  • Of the 1300 patients being tested, how many false-positive ELISA tests would be expected?
  • Of the false positives, how many indeterminant western blots could be expected?
  • How would the hospital address any cases in which a patient’s western blot was indeterminant?

Jump to the previous Clinical Focus box. Jump to the next Clinical Focus box.

Catatan kaki

    Thomas, Justin G., Victor Jaffe, Judith Shaffer, and Jose Abreu, “HIV Testing: US Recommendations 2014,” Osteopathic Family Physician 6, tidak. 6 (2014).

Sebagai Associate Amazon, kami memperoleh penghasilan dari pembelian yang memenuhi syarat.

Ingin mengutip, membagikan, atau memodifikasi buku ini? Buku ini adalah Creative Commons Attribution License 4.0 dan Anda harus mengaitkan OpenStax.

    Jika Anda mendistribusikan kembali semua atau sebagian dari buku ini dalam format cetak, maka Anda harus menyertakan pada setiap halaman fisik atribusi berikut:

  • Gunakan informasi di bawah ini untuk menghasilkan kutipan. Sebaiknya gunakan alat kutipan seperti ini.
    • Authors: Nina Parker, Mark Schneegurt, Anh-Hue Thi Tu, Philip Lister, Brian M. Forster
    • Penerbit/situs web: OpenStax
    • Book title: Microbiology
    • Publication date: Nov 1, 2016
    • Lokasi: Houston, Texas
    • Book URL: https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-4-eias-and-elisas

    © Aug 20, 2020 OpenStax. Konten buku teks yang diproduksi oleh OpenStax dilisensikan di bawah lisensi Creative Commons Attribution License 4.0. Nama OpenStax, logo OpenStax, sampul buku OpenStax, nama OpenStax CNX, dan logo OpenStax CNX tidak tunduk pada lisensi Creative Commons dan tidak boleh direproduksi tanpa persetujuan tertulis sebelumnya dan tersurat dari Rice University.


    Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs)

    NS enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are widely used EIAs. Dalam direct ELISA, antigens are immobilized in the well of a microtiter plate. An antibody that is specific for a particular antigen and is conjugated to an enzyme is added to each well. If the antigen is present, then the antibody will bind. After washing to remove any unbound antibodies, a colorless substrate (chromogen) is added. The presence of the enzyme converts the substrate into a colored end product (Figure 1). While this technique is faster because it only requires the use of one antibody, it has the disadvantage that the signal from a direct ELISA is lower (lower sensitivity).

    Di sebuah sandwich ELISA, the goal is to use antibodies to precisely quantify specific antigen present in a solution, such as antigen from a pathogen, a serum protein, or a hormone from the blood or urine to list just a few examples. The first step of a sandwich ELISA is to add the primary antibody to all the wells of a microtiter plate (Figure 3). The antibody sticks to the plastic by hydrophobic interactions. After an appropriate incubation time, any unbound antibody is washed away. Comparable washes are used between each of the subsequent steps to ensure that only specifically bound molecules remain attached to the plate. A blocking protein is then added (e.g., albumin or the milk protein casein) to bind the remaining nonspecific protein-binding sites in the well. Some of the wells will receive known amounts of antigen to allow the construction of a standard curve, and unknown antigen solutions are added to the other wells. The primary antibody captures the antigen and, following a wash, the secondary antibody is added, which is a polyclonal antibody that is conjugated to an enzyme. After a final wash, a colorless substrate (chromogen) is added, and the enzyme converts it into a colored end product. The color intensity of the sample caused by the end product is measured with a spektrofotometer. The amount of color produced (measured as absorbance) is directly proportional to the amount of enzyme, which in turn is directly proportional to the captured antigen. ELISAs are extremely sensitive, allowing antigen to be quantified in the nanogram (10 –9 g) per mL range.

    Figure 3. Click for a larger image. (a) In a sandwich ELISA, a primary antibody is used to first capture an antigen with the primary antibody. A secondary antibody conjugated to an enzyme that also recognizes epitopes on the antigen is added. After the addition of the chromogen, a spectrophotometer measures the absorbance of end product, which is directly proportional to the amount of captured antigen. (b) An ELISA plate shows dilutions of antibodies (left) and antigens (bottom). Higher concentrations result in a darker final color. (credit b: modification of work by U.S. Fish and Wildlife Service Pacific Region)

    In an indirect ELISA, we quantify antigen-specific antibody rather than antigen. We can use indirect ELISA to detect antibodies against many types of pathogens, including Borrelia burgdorferi (Lyme disease) dan HIV. There are three important differences between indirect and direct ELISAs as shown in Figure 4. Rather than using antibody to capture antigen, the indirect ELISA starts with attaching known antigen (e.g., peptides from HIV) to the bottom of the microtiter plate wells. After blocking the unbound sites on the plate, patient serum is added if antibodies are present (primary antibody), they will bind the antigen. After washing away any unbound proteins, the secondary antibody with its conjugated enzyme is directed against the primary antibody (e.g., antihuman immunoglobulin). NS secondary antibody allows us to quantify how much antigen-specific antibody is present in the patient’s serum by the intensity of the color produced from the conjugated enzyme-chromogen reaction.

    As with several other tests for antibodies discussed in this chapter, there is always concern about cross-reactivity with antibodies directed against some other antigen, which can lead to false-positive results. Thus, we cannot definitively diagnose an HIV infection (or any other type of infection) based on a single indirect ELISA assay. We must confirm any suspected positive test, which is most often done using either an immunoblot that actually identifies the presence of specific peptides from the pathogen or a test to identify the nucleic acids associated with the pathogen, such as reverse transcriptase PCR (RT-PCR) or a nucleic acid antigen test.

    Figure 4. Click for a larger image. The indirect ELISA is used to quantify antigen-specific antibodies in patient serum for disease diagnosis. Antigen from the suspected disease agent is attached to microtiter plates. The primary antibody comes from the patient’s serum, which is subsequently bound by the enzyme-conjugated secondary antibody. Measuring the production of end product allows us to detect or quantify the amount of antigen-specific antibody present in the patient’s serum.

    Pikirkan tentang itu

    • What is the purpose of the secondary antibody in a direct ELISA?
    • What do the direct and indirect ELISAs quantify?

    Clinical Focus: HIV Part 2

    This example continues the story that started in Polyclonal and Monoclonal Antibody Production.

    Although contacting and testing the 1300 patients for HIV would be time consuming and expensive, administrators hoped to minimize the hospital’s liability by proactively seeking out and treating potential victims of the rogue employee’s crime. Early detection of HIV is important, and prompt treatment can slow the progression of the disease.

    There are a variety of screening tests for HIV, but the most widely used is the indirect ELISA. As with other indirect ELISAs, the test works by attaching antigen (in this case, HIV peptides) to a well in a 96-well plate. If the patient is HIV positive, anti-HIV antibodies will bind to the antigen and be identified by the second antibody-enzyme conjugate.

    • How accurate is an indirect ELISA test for HIV, and what factors could impact the test’s accuracy?
    • Should the hospital use any other tests to confirm the results of the indirect ELISA?

    We’ll return to this example later on this page.


    Our ELISAs are a convenient and user-friendly method for studying soluble protein biomarkers in a variety of matrices including serum, plasma, cell culture supernatant, or lysate. Our ELISA offering consists of >1,000 Research Use Only assays, against a wide variety of species including human, mouse, rat, and various other animal models (Agricultural and Companion). Each assay comes with a specific protocol and the required reagents to run a 96-well plate. ELISAs primarily exist in a 96-well format with the vendor providing the reagents necessary to detect and quantitate the target. There are a variety of ELISA methods including Sandwich, Direct, and Competitive.

    The sandwich assay uses a pair of monoclonal antibodies (mAbs) against different epitopes against the same target. The primary mAb, bound to the plate, pulls the protein out of the solution while the second mAb is used to complete the “sandwich” and provide the signal which will indicate the presence of the target. A known amount of the recombinant version of the protein is provided with the kit, allowing the user to create a standard curve against which the signal from one of the samples will be interpreted. The majority of our portfolio is in this sandwich ELISA format.

    The direct ELISA and competitive assays are rarer. The direct assay uses a single mAb to detect the sample which is bound to the plate. The mAb is then bound by a reporter secondary antibody to provide the signal.

    The competitive assay has a known amount of the biomarker pre-bound to the plate. A labeled antibody is co-incubated with the sample which “mops up” the antibody depending on the concentration of the target in the sample. The free antibody is then able to bind to the antigen on the plate and provide a signal after the sample is washed away. In this case, the signal is inversely proportional to the concentration of the target biomarker.


    [28] Enzyme immunoassay ELISA and EMIT

    This chapter discusses the enzyme immunoassay ELISA and EMIT. Enzyme immunoassays can be classified into two fundamentally different types of assays: heterogeneous and homogeneous enzyme immunoassays (EIA). The heterogeneous EIA that include the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are based on the same principles as are used in radioimmunoassays (RIA). After incubation of antigen and antibodies, the antigen–antibody complexes formed are separated from free antigen and antibody by one of a number of different techniques and the activity in one or both of the fractions is determined. In the homogeneous enzyme immunoassay that includes enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT), no such separation is necessary. The principle of EMIT is similar to the modified bacteriophage technique. Antigen-coupled enzyme shows a change in activity (infectivity) upon incubation with antibody. This change is inhibited when the binding of antibody to the antigen-coupled enzyme is prevented by the addition of free antigen. ELISA is generally applicable to the measurement of almost any antigen. In ELISA, the enzyme is a passive passenger through the actual immunoassay. In EMIT, the enzyme plays a key role throughout the assay process. ELISA requires very little knowledge of enzyme technology, whereas enzymology is the key to success in EMIT.


    Assay Principles in Clinical Pathology

    Enzim

    EIAs are among the most popular types of immunoassay and employ enzymes as labels. The most common enzyme labels are ALP, HRP, glucose-6-dehydrogenase, and beta-galactosidase. Various detection systems have been used for enzyme labels, including colorimetric assays (monitored visually or photometrically), fluorogenic, and the more sensitive chemiluminescent assays (e.g., adamantyl dioxetane substrates for ALP).

    Examples of EIA include ELISA, EMIT, and CEDIA. ELISA is a heterogeneous EIA technique in which one of the reaction components (e.g., a capture antibody) is attached through nonspecific adsorption or chemically to the surface of a solid phase (e.g., inside surface of a microwell or surface of a magnetic microparticle). The immobilized antibody captures the antigen (analyte), which in turn binds to labeled antibody (conjugate) to form a sandwich of solid-phase Ab:Ag:Ab enzyme. Antibodies in a sample also are quantified by an ELISA procedure in which antigen instead of antibody is bound to a solid phase, and the second reagent is an enzyme-labeled antibody specific for the analyte antibody.

    EMIT is a type of homogeneous EIA used to develop a wide variety of small molecule assays (e.g., drugs). This type of mix and measure assay is easily automated (e.g., using an automated clinical chemistry analyzer). In the EMIT technique, the analyte (e.g., a drug) competes with and enzyme-labeled analyte for binding to the antianalyte antibody. Binding of the analyte antibody to the enzyme–analyte conjugate affects the enzyme and alters its activity (eqn [5] ). The change in enzyme activity is proportional to the analyte concentration in the patient's sample:

    CEDIA is another type of homogeneous EIA. It utilizes inactive fragments (the enzyme donor and acceptor) of β-galactosidase. These two fragments spontaneously reassemble to form active enzyme even if the enzyme donor is attached to an antigen. However, binding of an antibody to the enzyme donor–antigen conjugate inhibits reassembly, thereby blocking the formation of active enzyme. Thus, competition between antigen and the enzyme donor–antigen conjugate for a fixed amount of antibody in the presence of the enzyme acceptor modulates the measured enzyme activity such that high concentrations of antigen produce the least inhibition of enzyme activity and low concentrations, the greatest (eqn [6] ):


    Immunofiltration and Immunochromatographic Assays

    ​For some situations, it may be necessary to detect or quantify antigens or antibodies that are present at very low concentration in solution. Immunofiltration techniques have been developed to make this possible. Di dalam immunofiltration, a large volume of fluid is passed through a porous membrane into an absorbent pad. An antigen attached to the porous membrane will capture antibody as it passes alternatively, we can also attach an antibody to the membrane to capture antigen.

    The method of immunofiltration has been adapted in the development of immunochromatographic assays, commonly known as lateral flow tests or strip tests. These tests are quick and easy to perform, making them popular for point-of-care use (i.e., in the doctor’s office) or in-home use. One example is the TORCH test that allows doctors to screen pregnant women or newborns for infection by an array of viruses and other pathogens (Toxoplasma, other viruses, rubella, cytomegalovirus, herpes simplex). In-home pregnancy tests are another widely used example of a lateral flow test (Figure 5). Immunofiltration tests are also popular in developing countries, because they are inexpensive and do not require constant refrigeration of the dried reagents. However, the technology is also built into some sophisticated laboratory equipment.

    In lateral flow tests (Figure 6), fluids such as urine are applied to an absorbent pad on the test strip. The fluid flows by capillary action and moves through a stripe of beads with antibodies attached to their surfaces. The fluid in the sample actually hydrates the reagents, which are present in a dried state in the stripe. Antibody-coated beads made of latex or tiny gold particles will bind antigens in the test fluid. The antibody-antigen complexes then flow over a second stripe that has immobilized antibody against the antigen this stripe will retain the beads that have bound antigen. A third control stripe binds any beads. A red color (from gold particles) or blue (from latex beads) developing at the test line indicates a positive test. If the color only develops at the control line, the test is negative.

    Like ELISA techniques, lateral flow tests take advantage of antibody sandwiches, providing sensitivity and specificity. While not as quantitative as ELISA, these tests have the advantage of being fast, inexpensive, and not dependent on special equipment. Thus, they can be performed anywhere by anyone. There are some concerns about putting such powerful diagnostic tests into the hands of people who may not understand the tests’ limitations, such as the possibility of false-positive results. While home pregnancy tests have become widely accepted, at-home antibody-detection tests for diseases like HIV have raised some concerns in the medical community. Some have questioned whether self-administration of such tests should be allowed in the absence of medical personnel who can explain the test results and order appropriate confirmatory tests. However, with growing numbers of lateral flow tests becoming available, and the rapid development of lab-on-a-chip technology ([link]), home medical tests are likely to become even more commonplace in the future.

    Gambar 5. A lateral flow test detecting pregnancy-related hormones in urine. The control stripe verifies the validity of the test and the test line determines the presence of pregnancy-related hormones in the urine. (credit: modification of work by Klaus Hoffmeier)​ Gambar 6. Immunochromatographic assays, or lateral flow tests, allow the testing of antigen in a dilute solution. As the fluid flows through the test strip, it rehydrates the reagents. Antibodies conjugated to small particles bind the antigen in the first stripe and then flow onto the second stripe where they are bound by a second, fixed antibody. This produces a line of color, depending on the color of the beads. The third, control stripe binds beads as well to indicate that the test is working properly. (credit: modification of work by Yeh CH, Zhao ZQ, Shen PL, Lin YC)​
    • ​What physical process does the lateral flow method require to function?
    • Explain the purpose of the third strip in a lateral flow assay.

    ​Table compares some of the key mechanisms and examples of some of the EIAs discussed in this section as well as immunoblots, which were discussed in Detecting Antigen-Antibody Complexes.​

    Immunoblots & Enzyme Immunoassays

    ​PART 3

    ​Although the indirect ELISA for HIV is a sensitive assay, there are several complicating considerations. First, if an infected person is tested too soon after becoming infected, the test can yield false-negative results. The seroconversion window is generally about three weeks, but in some cases, it can be more than two months.

    In addition to false negatives, false positives can also occur, usually due to previous infections with other viruses that induce cross-reacting antibodies. The false-positive rate depends on the particular brand of test used, but 0.5% is not unusual. 1 Because of the possibility of a false positive, all positive tests are followed up with a confirmatory test. This confirmatory test is often an immunoblot (western blot) in which HIV peptides from the patient’s blood are identified using an HIV-specific mAb-enzyme conjugate. A positive western blot would confirm an HIV infection and a negative blot would confirm the absence of HIV despite the positive ELISA.

    Unfortunately, western blots for HIV antigens often yield indeterminant results, in which case, they neither confirm nor invalidate the results of the indirect ELISA. In fact, the rate of indeterminants can be 10–49% (which is why, combined with their cost, western blots are not used for screening). Similar to the indirect ELISA, an indeterminant western blot can occur because of cross-reactivity or previous viral infections, vaccinations, or autoimmune diseases.

    • Of the 1300 patients being tested, how many false-positive ELISA tests would be expected?
    • Of the false positives, how many indeterminant western blots could be expected?
    • How would the hospital address any cases in which a patient’s western blot was indeterminant?

    Jump to the previous Clinical Focus box. Jump to the next Clinical Focus box.


    Tonton videonya: The Principle of Immunoassays. ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Agustus 2022).