Informasi

Mengapa banyak larutan DNA mengandung senyawa tambahan?

Mengapa banyak larutan DNA mengandung senyawa tambahan?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Data kelarutan DNA hanya dalam air langka.

Pertanyaan sebelumnya menanyakan kuantifikasi kelarutan DNA dalam air. Sepertinya itu akan mudah dijawab, namun tidak sesederhana itu karena tampaknya tidak ada data untuk kelarutan DNA dalam eksklusif air.

Bahkan sejumlah kecil data tentang air dalam konteks membersihkan senyawa organik dari larutan. Ini membuatku berpikir. DNA berada dalam larutan berair dalam situasi biologis, dan biasanya ditangani dalam larutan berair di laboratorium. Jadi mengapa data kelarutan sangat langka untuk murni air? Apa yang penting tentang senyawa organik untuk larutan DNA?

Mengapa aditif lain penting untuk larutan DNA laboratorium?

Jadi pertanyaan saya adalah mengapa apakah DNA larut dalam eksklusif air tampaknya "jarang" di laboratorium? Apakah ada sesuatu tentang air murni yang buruk untuk penyimpanan DNA? Apakah secara fungsional DNA tidak perlu berada di dalam air karena tidak dapat diakses oleh protein? Atau apakah saya salah mengartikan kurangnya data kelarutan; air adalah tempat biasa dan tidak ada data karena tidak perlu?

Saya membayangkan PCR adalah tempat sebagian besar data tentang solusi DNA ada. Bagaimana dengan pelarut/senyawa organik polar yang menjadikannya penting untuk larutan DNA?


DNA dalam air murni.

Satu-satunya waktu asam nukleat akan bertemu dengan air murni adalah dalam pengaturan laboratorium - misalnya setelah oligonukleotida disintesis secara in vitro, gugus pelindung dihilangkan dari atom reaktif dalam urutan akhir dan produk akhir dipisahkan dari pendukung. matriks. Pada saat itu Anda dapat liofilisasi (beku kering) larutan amonium hidroksida, dan suspensi ulang oligo untai tunggal dalam air murni.

Senyawa tambahan meningkatkan kelarutan oligomer berat.

Namun, seperti dicatat dalam komentar, kelarutan asam nukleat, khususnya DNA dengan berat molekul tinggi, seperti DNA genom, ditingkatkan dalam larutan dengan kation monovalen encer. 10 mM TrisHCl, pH 8.0, 1 mM EDTA cukup untuk hampir semua aplikasi. EDTA menghambat DNAse yang salah, dan juga sedikit menghambat pertumbuhan mikroba.

Senyawa bertindak sebagai buffer pH.

Tris bukanlah buffer biologis terbaik tetapi memiliki kelarutan tinggi dan relatif murah dan stabil. Jika larutan menjadi terlalu basa, untaian DNA akan meleleh, dan jika larutan menjadi terlalu asam, purin akan mulai mengalami deaminasi.

DNA tidak pernah mengalami air murni dalam biologi.

Dari saat DNA disintesis dalam sel sampai sel itu mati dan DNA-nya akhirnya terdegradasi, ia tidak menemukan lingkungan air murni.


Sementara eksperimen fisiologis dapat dilakukan tanpa pelarut organik, sintesis kimia DNA atau analog, modifikasi kimia DNA, dan pemurnian setelah reaksi kimia dapat dilakukan dengan adanya pelarut organik. Eksperimen semacam itu tidak secara langsung relevan dengan fisiologi, tetapi kami menggunakan DNA dan analog DNA yang disintesis secara kimia. Selain itu, sifat kimia DNA dengan adanya pelarut organik dapat menunjukkan bagaimana DNA berperilaku dalam kondisi fisiologis. Orang yang melakukan PCR dan/atau biologi molekuler mungkin tidak tertarik dengan kelarutan DNA, karena dalam kondisi yang mereka gunakan, konsentrasinya jauh lebih kecil daripada kondisi jenuh.


Mengapa banyak larutan DNA mengandung senyawa tambahan? - Biologi

Sejak penemuan asam nukleat oleh Fredrick Miescher pada tahun 1870, mereka telah lama dianggap sebagai sesuatu yang menarik sampai struktur unit monomer, nukleotida, didirikan pada tahun 1909 dan RNA diusulkan oleh Levene dan Tipson pada tahun 1935. Asam nukleat pada dasarnya terdiri dari dua jenis - DNA dan RNA, yang merupakan polimer rantai nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari tiga bagian, pertama - bagian gula yang merupakan pentosa (cincin beranggota lima) yang bergabung dengan bagian kedua gugus fosfat. Karbon anomerik dari setiap gula terikat pada atom nitrogen dari bagian ketiga - senyawa heterosiklik dalam ikatan -glikosidik. Ikatan dinamakan demikian, karena substituen pada C-1 dan C-4 berada pada sisi yang sama dari cincin furanosa.

Karena senyawa heterosiklik yang membentuk bagian dari asam nukleat mengandung gugus amina dan pada umumnya amina bertindak sebagai basa, senyawa heterosiklik ini juga secara sewenang-wenang disebut sebagai basa. Selain itu, karena atom hetero dalam cincin adalah Nitrogen- senyawa ini disebut sebagai Basa Nitrogen. Basa nitrogen adalah molekul planar, aromatik, heterosiklik yang sebagian besar merupakan turunan purin atau pirimidin. Hanya ada empat basa dalam DNA — dua purin tersubstitusi (adenin dan guanin), dan dua pirimidin tersubstitusi (sitosin dan timin). RNA juga hanya mengandung empat basa. Tiga (adenin, guanin, dan sitosin) sama dengan yang ada pada DNA, tetapi basa keempat dalam RNA adalah urasil, bukan timin. Timin dan urasil hanya berbeda pada gugus metil—timin adalah 5-metilurasil.

Mengapa asam nukleat hanya mengandung gula Ribosa atau Deoksi-Ribosa?
Dalam RNA gula cincin beranggota lima adalah D-ribosa. Dalam DNA itu adalah 2'-deoksi-D-ribosa (D-ribosa tanpa gugus OH di posisi 2). Pilihan cincin beranggota lima adalah secara default karena cincin ini adalah yang paling stabil di antara senyawa aromatik kecuali dalam kasus benzena, cincin beranggota enam yang distabilkan oleh resonansi. Di antara pentosa, Ribosa dipilih selama evolusi, sebagai komponen gula eksklusif dari asam nukleat. Seleksi dijelaskan dengan menggunakan model molekul dan dengan menghilangkan sebagian besar gula umum lainnya dengan melihat struktur kimianya dan membayangkan bagaimana mereka akan cocok dalam model asam nukleat. Perbandingan konformasi kerutan gula dan konfigurasi pentosa menunjukkan bahwa ribosa tidak dipilih secara acak tetapi satu-satunya pilihan, karena -D-ribosa paling cocok dengan struktur bentuk fisiologis asam nukleat. Dalam nukleotida lain yang mengandung arabinosa, xilosa, atau likosa, C2'-OH dan/atau C3'-OH berada di atas cincin furanosa, menyebabkan interferensi sterik dengan basa besar dan gugus C5'-OH.

Mengapa asam nukleat bermuatan negatif?
Asam fosfat menghubungkan gula dalam RNA dan DNA. Asam memiliki tiga gugus OH yang dapat dipisahkan dengan nilai pKa 1,9, 6,7, dan 12,4. Masing-masing gugus –OH dari asam fosfat sama-sama mampu bereaksi dengan alkohol (asam + alkohol -> ester) untuk menghasilkan fosfomonoester, fosfodiester, atau fosfotriester. Dalam asam nukleat, gugus fosfat hanya membentuk fosfodiester. Meskipun asam fosfat mampu membentuk tiga ikatan ester, asam fosfat hanya membentuk dua ikatan, meninggalkan gugus –OH ketiga bebas, yang pada saat disosiasi memberikan muatan negatif. Dalam kasus RNA, penambahan gugus 2'-OH juga menambah muatan negatif. Oleh karena itu RNA memiliki muatan lebih dan karena itu kurang stabil dan menunjukkan mobilitas yang lebih besar pada elektroforesis daripada DNA.


Pemanasan molekul asam fosfat menghasilkan pembentukan asam pirofosfat, yang merupakan fosfoanhidrida. dibentuk oleh hilangnya molekul air. Nama pirofosfat berasal dari kata Yunani - pyr, yang berarti "api." Jadi, asam pirofosfat dibuat dengan "api"—yaitu, dengan pemanasan. Dengan cara tersebut di atas, asam trifosfat dan asam polifosfat yang lebih tinggi juga dapat dibentuk, karena kemampuan asam fosfat untuk membentuk anhidrida.

Nukleotida dapat eksis sebagai monofosfat, difosfat, dan trifosfat dan diberi nama dengan menambahkan monofosfat atau difosfat atau trifosfat ke nama nukleosida. Ikatan fosfoanhidrida ini adalah ikatan energi tinggi yang berarti bahwa ketika ikatan ini diputus, mereka melepaskan banyak energi, yang dapat digunakan secara bersamaan untuk mendorong reaksi kimia lain di dalam sel.

Purin dan pirimidin terikat pada karbon anomerik dari cincin furanosa—purin pada N-9 dan pirimidin pada N-1—dalam ikatan -glikosidik. Senyawa yang mengandung basa yang terikat pada D-ribosa atau 2'-deoksi-D-ribosa disebut Nukleosida. Dalam nukleosida, posisi cincin gula ditunjukkan dengan bilangan prima untuk membedakannya dari posisi cincin basa. Inilah sebabnya mengapa komponen gula DNA disebut sebagai 2'-deoksi-D-ribosa. Misalnya, adenin adalah basa, sedangkan adenosin adalah nukleosida. Demikian pula, sitosin adalah basa, sedangkan sitidin adalah nukleosida, dan sebagainya. Urasil hanya ditemukan dalam RNA dan oleh karena itu melekat pada D-ribosa tetapi tidak pada 2-deoksi-D-ribosa. Demikian pula, karena timin hanya ditemukan dalam DNA, ia melekat pada 2-deoksi-D-ribosa tetapi tidak pada D-ribosa.

Nukleotida adalah nukleosida dengan gugus 5' atau 3'-OH yang terikat dalam ikatan ester dengan asam fosfat. Nukleotida RNA—di mana gulanya adalah D-ribosa—lebih tepatnya disebut ribonukleotida, sedangkan nukleotida DNA—di mana gulanya adalah 2-deoksi-D-ribosa—disebut deoksiribonukleotida.

Fungsi biologis Nukleotida:
Nukleotida selain bertindak sebagai unit integral DNA dan RNA, tmelakukan berbagai aktivitas seluler seperti donor energi kimia, pembawa pesan sekunder dalam pensinyalan sel, kofaktor untuk enzim, sebagai vasidialtor, pembawa subunit yang diperlukan dalam sintesis dinding sel dan biosintesis lipid.

ATP- Mata uang sel:
Semua sistem kehidupan membutuhkan energi untuk memastikan kelangsungan hidup dan reproduksi mereka dan mereka memperoleh energi dengan mengubah nutrisi menjadi bentuk energi yang berguna secara kimia. Bentuk energi kimia yang paling penting adalah adenosin-trifosfat (ATP). Pentingnya ATP untuk reaksi biologis ditunjukkan oleh tingkat pergantiannya pada manusia—setiap hari, seseorang menggunakan jumlah ATP yang setara dengan berat tubuhnya. ATP dikenal sebagai pembawa universal energi kimia karena umumnya digunakan di semua sistem kehidupan dari prokariota hingga eukariota. ATP memiliki kemampuan untuk mengubah reaksi termodinamika yang tidak menguntungkan menjadi reaksi yang menguntungkan karena “energi hidrolisis ATP mengubah reaksi endergonik menjadi reaksi eksergonik.”

Rahasia di balik stabilitas ATP:
Seperti yang dapat diperhatikan dari struktur ATP, bahwa ia sangat negatif karena setiap nukleotida trifosfat memiliki empat unit muatan negatif dan harus sangat reaktif dan dengan demikian membuatnya kurang stabil. Mempertimbangkan fakta di atas, meskipun ATP bereaksi dengan mudah dalam reaksi yang dikatalisis enzim, tetapi yang mengejutkan, laju reaksinya cukup lambat tanpa adanya enzim. Jika dibandingkan dengan anhidrida asam karboksilat yang terhidrolisis dalam hitungan menit, ATP membutuhkan waktu beberapa minggu untuk terhidrolisis. Tingkat hidrolisis ATP yang rendah merupakan konsekuensi yang menguntungkan bagi sel karena dapat dipertahankan dalam sel untuk jangka waktu yang lebih lama dan tersedia bila diperlukan untuk reaksi yang dikatalisis enzim. Sangat menarik untuk mengetahui bahwa alasan di balik reaktivitas ATP yang lambat tanpa adanya enzim adalah muatan negatifnya yang menolak pendekatan nukleofil. Ketika ATP terikat di situs aktif enzim, kompleks dengan magnesium yang menurunkan keseluruhan muatan negatif pada ATP. Inilah sebabnya mengapa enzim yang membutuhkan ATP juga membutuhkan ion logam. Dua muatan negatif lainnya dapat distabilkan oleh gugus bermuatan positif seperti residu arginin atau lisin pada sisi aktif. Dalam bentuk ini, ATP mudah didekati oleh nukleofil, sehingga ATP bereaksi cepat dalam reaksi yang dikatalisis enzim, tetapi hanya sangat lambat jika tidak ada enzim.

  • ATP bukan satu-satunya nukleotida yang penting secara biologis. Guanosine-triphosphate (GTP) juga digunakan sebagai pengganti ATP dalam beberapa reaksi transfer fosforil. GTP mendorong pembentukan ikatan peptida selama translasi. GTP dan GDP juga terlibat dalam pensinyalan yang dimediasi G-protein Coupled Receptor (GPCR).
  • UDP berfungsi sebagai pembawa bagian Glukosa dalam bentuk UDP-Glukosa, yang diperlukan untuk sintesis dinding sel pada bakteri.
  • CDP-Choline bertindak sebagai pembawa kelompok Kolin untuk sintesis membran fosfolipid-Fosfotidil Kolin.
  • Dinukleotida seperti FAD, FMN digunakan sebagai zat pengoksidasi dan NADH, NADPH digunakan sebagai zat pereduksi.
  • Nukleotida penting lainnya adalah adenosin – monofosfat, umumnya dikenal sebagai AMP siklik. Cyclic AMP disebut “second messenger” karena berfungsi sebagai penghubung antara beberapa hormon (perpesanan pertama) dan enzim tertentu yang mengatur fungsi seluler. Sekresi hormon tertentu, seperti adrenalin, mengaktifkan adenilat siklase, enzim yang bertanggung jawab untuk sintesis AMP siklik dari ATP. AMP siklik kemudian mengaktifkan enzim, umumnya dengan memfosforilasinya.
  • Adenosin bertindak sebagai penginduksi tidur dan tersedia secara komersial sebagai "Adenocarp"

Agen pereduksi adalah NADPH dan setiap NADPH yang diproduksi dalam sel dapat menghasilkan tiga ATP. Berdasarkan fakta ini, penggunaan NADPH untuk mereduksi dihydrofolate datang dengan mengorbankan ATP. Meskipun proses sintesis timin sangat mahal, sel lebih memilih untuk merekrut Timin dalam DNA daripada Urasil.
Kehadiran urasil dalam DNA bersifat mutagenik dan kehadiran timin mencegah mutasi yang berpotensi mematikan. Fenomena kimia di balik ini adalah ketidakstabilan kimia Sitosin yang dapat ditautomerisasi membentuk imina, yang selanjutnya dihidrolisis menjadi urasil. Reaksi keseluruhan disebut deaminasi karena menghilangkan gugus amino.
Jika sitosin dalam DNA dideaminasi menjadi urasil, urasil akan menentukan penggabungan adenin ke dalam untai anak selama replikasi alih-alih guanin yang akan ditentukan oleh sitosin. Ini akan memiliki efek buruk karena mengarah pada perubahan urutan nukleotida dan dapat menyebabkan pasangan basa GC menjadi mutasi pasangan basa AT. Untuk menghindari komplikasi seperti itu, kehadiran U dalam DNA diakui sebagai "kesalahan" oleh enzim seluler sebelum basa yang salah dapat dimasukkan ke dalam untai anak. Urasil-N-glikolsilase dan dUTPase adalah dua enzim yang memastikan penghapusan U dari DNA. dUTPase memotong molekul UTP yang ada dalam nukleus dan mencegahnya masuk ke situs aktif DNA polimersase. Jika ada U yang dimasukkan ke dalam DNA, Urasil-N-glikolsilase memotong ikatan glikosidik dan menghilangkan nukleotida dari DNA. Ini menghasilkan situs apyrimidinic yang dikenali sebagai lesi dan selanjutnya diperbaiki oleh enzim perbaikan.
Jika U biasanya ditemukan dalam DNA, enzim tidak dapat membedakan antara U normal dan U yang dibentuk oleh deaminasi sitosin. Memiliki T di tempat U dalam DNA memungkinkan U yang ditemukan dalam DNA dikenali sebagai kesalahan. Tidak seperti DNA, yang mereplikasi dirinya sendiri, kesalahan apa pun dalam RNA tidak bertahan lama karena RNA terus-menerus didegradasi dan kemudian disintesis ulang dari cetakan DNA. Oleh karena itu, tidak ada gunanya menghabiskan energi ekstra untuk memasukkan T ke dalam RNA.

Sifat asam nukleat:
Pengaruh suhu
Struktur asam nukleat dupleks terganggu atau terdenaturasi pada suhu tinggi menjadi molekul beruntai tunggal dan prosesnya disebut sebagai 'peleburan', proses peleburan heliks ganda dapat dipantau dengan mudah karena penumpukan basa dan interaksi pasangan basa secara signifikan mengurangi penyerapan UV. Ketika suhu larutan yang mengandung dupleks polinukleotida dinaikkan, penyerapan sinar UV akan sangat meningkat di sekitar suhu di mana dua untai terpisah menjadi polinukleotida beruntai tunggal. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa molekul beruntai tunggal menunjukkan penyerapan UV yang lebih tinggi daripada molekul beruntai ganda pada panjang gelombang 260 nm. Transisi dalam penyerapan UV biasanya terjadi pada rentang 48?C hingga 88?C. Ketika plot digambar dengan Absorbansi pada sumbu X dan Temperatur pada sumbu Y, itu disebut sebagai kurva Melting. Titik tengah kurva transisi atau leleh di mana setengah dari spesies polinukleotida adalah dupleks dan setengahnya beruntai tunggal diidentifikasi sebagai suhu leleh (Tm). Secara umum, dupleks DNA relatif kurang stabil terhadap denaturasi termal dibandingkan dupleks RNA atau dupleks RNA-DNA.

Pergeseran hiperkromik: Peningkatan penyerapan pada 260nm pada denaturasi DNA untai ganda yang menghasilkan pembentukan DNA untai tunggal disebut sebagai pergeseran hiperkromik.

Pergeseran hipokromik: Penurunan penyerapan pada 260nm pada renaturasi molekul DNA beruntai tunggal untuk menghasilkan DNA beruntai ganda disebut sebagai pergeseran hipokromik. Renaturasi dengan pendinginan lambat disebut Annealing.

Tm untuk dupleks tertentu dipengaruhi oleh sejumlah faktor. Penentu utama termasuk panjang urutan, konten G-C dan konsentrasi garam. Dupleks yang lebih panjang atau yang memiliki proporsi pasangan G-C yang lebih tinggi lebih stabil dan karenanya akan memiliki Tm yang lebih tinggi. Kation monovalen, seperti natrium (Na+) dan kalium (K+), menstabilkan heliks ganda dengan menetralkan sebagian muatan negatif di sepanjang tulang punggung fosfodiester. Akibatnya, konsentrasi garam yang lebih tinggi juga akan meningkatkan Tm dari dupleks polinukleotida yang diberikan. Selain itu, keberadaan basa yang tidak cocok dalam dupleks umumnya akan memiliki efek destabilisasi dan penurunan Tm.

  1. Absorbansi Pada 260 nm dalam urutan menurun.
    Penyerapan nukleotida bebas lebih banyak bentuk polimernya dan molekul beruntai tunggal menyerap lebih dari bentuk beruntai ganda. Demikian pula penyerapan RNA lebih dari DNA karena adanya gugus 2'-OH. Purin menyerap lebih dari pirimidin karena adanya struktur cincin ganda. Di antara purin, Adenin menyerap lebih banyak daripada Guanin karena adanya lebih banyak elektron bebas. Akibatnya dua molekul DNA yang sama panjangnya tetapi berbeda dalam kandungan GC menyerap secara berbeda dengan DNA yang memiliki lebih banyak kandungan AT yang menyerap lebih banyak daripada DNA dengan kandungan GC yang lebih banyak.
    A260: Nukleotida > ss DNA > ds DNA
    A260: RNA > DNA
    A260: Purin > Pirimidin
    A260: Adenin > Guanin > Timin = Sitosin
  2. Tekanan osmotik meningkat pada denaturasi. Pelarut organik dan deterjen mengganggu interaksi hidrofobik dan menyebabkan denaturasi DNA.
  3. Viskositas menurun pada denaturasi. Solusi DNA sangat kental dan viskositas tinggi disebabkan oleh panjang panjang dan kekakuan molekul. Setelah denaturasi, viskositas menurun karena DNA untai ganda lebih kaku dan karenanya kental jika dibandingkan dengan DNA untai tunggal.
  4. Rotasi Optik menjadi lebih negatif pada denaturasi sebagai bidang cahaya terpolarisasi bergeser sedikit ke arah kiri (lebih negatif).
  5. Kepadatan asam nukleat meningkat pada denaturasi karena DNA untai ganda kurang padat jika dibandingkan dengan DNA untai tunggal karena menempati lebih banyak massa per volume tertentu.

Pengaruh pH pada asam nukleat:
Asam nukleat stabil antara kisaran pH 5-9. Di luar kisaran ini, mereka mengalami denaturasi secara spontan karena pergeseran tautomerik basa Nitrogen mengubah ikatan H- antara nukleotida dari untai yang berlawanan.

Pengaruh Asam pada asam nukleat:
Baik DNA dan RNA mengalami hidrolisis asam.Ikatan glikosidik dari nukleosida purin rentan terhadap hidrolisis asam melalui protonasi pada N7 guanosin atau adenosin. Dalam kondisi asam ringan DNA menjadi DNA Apurinat. Depurinasi DNA lebih menguntungkan daripada RNA, meskipun pembentukan situs basi dalam hasil polinukleotida dalam kedua kasus. Hilangnya informasi urutan secara lengkap yang diwakili oleh situs dasar dalam DNA juga dapat menyebabkan mutasi permanen.

Pengaruh Alkali pada asam nukleat:
RNA mengalami hidrolisis alkali karena adanya gugus 2'-OH tetapi DNA tidak mengalami hidrolisis alkali.
Meskipun RNA dan DNA dapat didegradasi melalui pembelahan tulang punggung fosfodiester, stabilitas kimianya sangat berbeda. RNA secara khusus mengalami reaksi transesterifikasi di mana oksigen C2 berfungsi sebagai nukleofil untuk menyerang fosfor yang berdekatan. Reaksi khusus ini berlangsung melalui perantara fosfat pentakoordinat, di mana ikatan terbentuk antara oksigen C2 dan pusat fosfor yang sejalan dengan ikatan yang akan diputuskan antara pusat fosfor dan oksigen C5. Akibatnya, produk reaksi berakhir dengan hidroksil C5’ dan C2’, fosfat siklik C3’. Mekanisme siklus transesterifikasi RNA ini terjadi dengan mudah karena nukleofil secara inheren diposisikan di dekat pusat fosfor di tulang punggung fosfodiester. Selain itu, reaksi dipromosikan baik dengan deprotonasi hidroksil C2' atau protonasi oksigen C5'. Oleh karena itu, RNA mudah terdegradasi dalam larutan basa atau asam. Mekanisme serupa berlaku untuk RNA dan polimer DNA, beroperasi untuk pembelahan fosfodiester, di mana molekul kedua berfungsi sebagai nukleofil penyerang. Reaksi ini sama dipromosikan oleh deprotonasi dari kelompok menyerang dan protonasi dari kelompok pergi. Namun, produk berakhir dengan fosfat C5' dan hidroksil C3'. Air dapat berfungsi sebagai nukleofil dalam degradasi hidrolitik spontan dari RNA atau polimer DNA, meskipun reaksi ini kira-kira 100.000 kali lebih kecil kemungkinannya terjadi daripada transesterifikasi RNA. Berdasarkan prinsip di atas dan fakta bahwa setiap gula tidak memiliki gugus hidroksil C2, tulang punggung fosfat dan gula DNA menunjukkan stabilitas kimia yang relatif besar. Faktanya, DNA adalah polimer biologis paling stabil yang memungkinkannya mempertahankan integritas informasi genetik - prasyarat untuk bertindak sebagai materi genetik.

Pengaruh bisulfit dan asam nitrat:
Bisulfit dan asam nitrit meningkatkan deaminasi atau penghilangan gugus amino dari sitosin, menghasilkan konversi sitosin menjadi urasil. Dalam DNA, deaminasi sitosin pada akhirnya akan menyebabkan konversi pasangan basa G-C menjadi pasangan basa A-T jika dibiarkan tidak dikoreksi.

Pengaruh Radiasi Pengion dan Agen Pengoksidasi:
Oksidator kuat seperti radikal hidroksil yang dihasilkan oleh radiasi pengion atau reduksi metabolik yang tidak lengkap dari oksigen yang menghasilkan ion superoksida, hidrogen peroksida atau radikal hidroksil bereaksi sangat hebat dengan DNA. Radikal hidroksil secara nonspesifik dapat merusak DNA dengan mematahkan tulang punggung fosfodiester. Pemotongan untai terjadi melalui sejumlah mekanisme, yang masing-masing menghasilkan fragmen polinukleotida dengan produk terminal 5'dan 3' yang berbeda. Selain itu, radikal hidroksil dapat secara langsung menyerang dan mengubah komposisi kimia basa dalam asam nukleat yang menghasilkan senyawa seperti 8-hidroksiguanin dan timin glikol. Modifikasi ini menghasilkan pembentukan lesi pada urutan DNA yang membuatnya rentan terhadap mutasi, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kanker. Oleh karena itu, radiasi pengion dan senyawa lain yang menyebabkan kerusakan DNA biasanya bersifat karsinogenik atau penyebab kanker.


Mekanisme aksi

DTT terlibat dalam reaksi pertukaran disulfida. DTT digunakan pada 1-10 mM untuk reduksi protein SS dan mampu melintasi membran biologis.

Mengurangi properti

Dithiothreitol adalah zat pereduksi kuat dengan potensial redoks -0,33 V pada pH 7. Reduksi ikatan disulfida diikuti oleh dua reaksi pertukaran tiol-disulfida berurutan (lihat Gambar 2 di bawah). Reduksi umumnya berlanjut melewati spesies campuran-disulfida karena tiol kedua di DTT memiliki kecenderungan yang meningkat untuk menutup cincin. Hal ini menyebabkan pembentukan DTT teroksidasi dan meninggalkan ikatan disulfida tereduksi. Daya reduksi DTT terbatas pada nilai pH lebih besar dari 7, karena hanya bentuk tiolat bermuatan negatif yang reaktif. Gugus tiol memiliki nilai pKa 9,2 dan 10,1.

Gambar 2: Reduksi ikatan disulfida tipikal oleh DTT melalui dua reaksi pertukaran tiol-disulfida berurutan


PROSEDUR LABORATORIUM

Ekstraksi DNA

Langkah-langkah kunci menuju ekstraksi DNA yang sukses adalah menggiling jaringan secukupnya dan mengidentifikasi protokol ekstraksi terbaik untuk tujuan yang ada. Ketersediaan peralatan dan infrastruktur laboratorium juga menjadi pertimbangan: saran untuk seperangkat peralatan laboratorium dan protokol dasar biologi molekuler diberikan dalam Lampiran 1.

Penggilingan jaringan tanaman secara efisien adalah langkah pertama menuju hasil DNA yang tinggi. Untuk homogenisasi yang efisien dan simultan dari beberapa sampel jaringan, kami menggunakan versi modifikasi dari penggiling berdasarkan gergaji reciprocating (Alexander et al., 2007 Lampiran 1) sebagai alternatif murah untuk pengocok manik yang tersedia secara komersial. Alu dan mortar dengan penambahan pasir perak tingkat biologi molekuler untuk membantu penggilingan dengan tangan dapat digunakan sebagai alternatif. Jika ukuran sampel minimal diperlukan dan jaringan lunak, mereka dapat digiling dalam tabung mikro dengan alu mikro (misalnya, katalog Geneaid no. MP050 Geneaid Biotech Ltd., New Taipei City, Taiwan).

Protokol ekstraksi DNA perlu dipertimbangkan dengan hati-hati. Tanaman, terutama tanaman tropis, mensintesis berbagai senyawa, seperti polisakarida dan polifenol (Coley dan Barone, 1996), yang dapat dimurnikan bersama dengan DNA dan dapat mengurangi hasil dan/atau menghambat reaksi PCR berikutnya. Dalam beberapa kasus, protokol ekstraksi perlu disesuaikan untuk memenuhi tantangan spesifik jaringan, dan mungkin sulit untuk menemukan metode tunggal yang bekerja dengan baik untuk semua sampel.

Metode ekstraksi DNA yang paling banyak digunakan dapat ditempatkan ke dalam salah satu dari dua kelompok: metode yang menggunakan kolom pengikatan DNA untuk memurnikan DNA, dan metode yang menggunakan metode kimia untuk memisahkan DNA dari konten seluler dalam larutan. Kolom pengikat DNA dapat diandalkan dan menghasilkan hasil yang konsisten, memerlukan lebih sedikit keahlian teknis untuk digunakan secara efektif, dan menghasilkan sedikit atau tidak ada limbah berbahaya. Kerugian utama adalah bahwa mereka bisa mahal, meskipun versi yang lebih murah tersedia, dan pertimbangan diperlukan untuk penghematan waktu dan tenaga yang dicapai dengan kit.

Jika metode berbasis partisi dipilih, kami merekomendasikan pencarian literatur untuk keberhasilan menggunakan metode tertentu untuk mengekstrak DNA dari taksa yang terkait erat, atau dari taksa dengan tantangan ekstraksi serupa (misalnya, polisakarida berlebih). Ada banyak metode ekstraksi DNA sederhana yang telah berhasil digunakan pada berbagai sampel termasuk jambu mete dan jagung (Sika et al., 2015), kentang (Hosaka, 2004), Rosaceae (Antanaviciute et al., 2015), dan beras ( Sajib et al., 2017 ) yang dapat diuji dan semoga berhasil. Jika tidak, metode CTAB yang dimodifikasi dengan menambahkan agen untuk menghilangkan metabolit sekunder spesifik adalah titik awal yang baik lihat Allen et al. (2006) dan Neubig dkk. (2014). Banyak dari metode ini memerlukan bahan kimia beracun seperti fenol dan kloroform, yang harus ditangani di lemari asam dan dibuang dengan aman sesuai dengan peraturan setempat menggunakan protokol yang ditetapkan. Lembar Data Keselamatan (SDS) yang menyertai semua bahan kimia yang dibeli dan tersedia secara online (misalnya, di www.sigmaaldrich.com) adalah sumber informasi keselamatan yang baik.

Untuk menemukan protokol ekstraksi terbaik untuk kebutuhan kami, kami menilai dua metode berbasis CTAB yang relatif murah dan cukup sederhana, dimodifikasi untuk dilakukan dalam tabung microfuge. Kedua protokol ini telah berhasil digunakan oleh Laboratorium Sistematika Molekuler LIPI untuk proyek-proyek khusus takson. Awalnya, kami mengekstraksi DNA dari jaringan 75 spesimen menggunakan metode ekstraksi Tel-Zur et al. (1999), dimodifikasi oleh Wendel (Lampiran 1). Setelah PCR, 63 spesimen tidak menghasilkan produk PCR yang cukup untuk mengurutkan keduanya rbcL dan matK (dibahas secara rinci di bawah). Oleh karena itu, kami mengekstrak DNA dari spesimen ini dan 331 spesimen lainnya, menggunakan metode ekstraksi Porebski et al. (1997), yang menghasilkan volume limbah kimia berbahaya yang lebih kecil tetapi termasuk satu langkah ekstra semalam dibandingkan dengan metode ekstraksi Wendel (Lampiran 1). Secara total, kami mengekstraksi DNA dari jaringan 406 spesimen. Sebagai perbandingan tambahan, kami menggunakan DNeasy Plant Mini Kit berbasis kolom (QIAGEN, Venlo, Belanda Lampiran 1) untuk mengekstraksi DNA dari jaringan subset 48 spesimen yang sebelumnya dikenai ekstraksi CTAB. Alur kerja biologi molekuler yang kami gunakan ditunjukkan pada Gambar 1, metode ekstraksi DNA dirinci dalam Lampiran 1, dan data ekstraksi DNA ditunjukkan pada Lampiran S1.

Dua pendekatan umum yang banyak digunakan untuk menentukan kuantitas dan kualitas ekstrak DNA. Elektroforesis gel sampel DNA dan tangga untuk kuantifikasi memungkinkan estimasi konsentrasi DNA dan penentuan apakah sampel terdegradasi atau sebagian besar mengandung fragmen dengan berat molekul tinggi. Spektrofotometri memungkinkan kuantitas untuk diperkirakan serta identifikasi beberapa kontaminan umum seperti protein dan fenol. Kami menggunakan elektroforesis gel karena kami tidak memiliki akses ke spektrofotometer yang sesuai. Kami mencoba PCR untuk semua sampel terlepas dari bukti degradasi DNA atau hasil rendah yang kami peroleh dari gel, meskipun keberhasilan PCR yang lebih rendah diharapkan dari upaya untuk memperkuat lokus dari DNA yang sangat terdegradasi.

Primer PCR dan amplifikasi

Diterbitkan, primer khusus takson untuk kelompok minat adalah titik awal yang baik untuk studi yang berfokus pada clade. Jika primer tersebut tidak tersedia atau, seperti kasus dalam penelitian kami, berbagai taksa sedang dipelajari, primer universal yang dirancang untuk bekerja melintasi taksa yang beragam secara filogenetik adalah pilihan yang baik (misalnya, yang direkomendasikan oleh Kelompok Kerja Pabrik CBOL 2009 ). Kriteria untuk primer yang direkomendasikan CBOL didasarkan pada universalitas (penguatan yang berhasil melintasi banyak taksa), kualitas dan cakupan sekuens (penguatan wilayah yang mengembalikan data sekuens berkualitas tinggi), dan diskriminasi (memungkinkan sebagian besar spesies untuk dibedakan). Urutan primer spesifik takson yang relevan masih dapat berguna untuk pemecahan masalah jika proyek memiliki cakupan yang luas tetapi hasil PCR yang buruk dikaitkan dengan taksa tertentu. Jika pendekatan ini tidak berhasil, primer dapat dirancang berdasarkan data urutan yang tersedia untuk umum. Idealnya, urutan keselarasan harus dihasilkan dari beberapa taksa yang terkait dengan taksa target sehingga cocok, daerah yang dilestarikan dapat diidentifikasi sebagai situs primer. Primer kemudian dapat dirancang untuk memperkuat wilayah yang diinginkan menggunakan perangkat lunak seperti PrimerDesign (Brodin et al., 2013) atau Primaclade (Gadberry et al., 2005). Lorenz (2012) menawarkan pedoman umum untuk desain primer PCR.

PCR dapat menjadi tantangan dan, untuk mencapai amplifikasi yang dapat direproduksi, sangat penting untuk menggunakan DNA berkualitas tinggi bila memungkinkan, dan untuk selalu menggunakan primer yang dirancang dengan baik dan reagen yang disiapkan dan disimpan dengan benar. Menyimpan DNA merupakan tantangan (Anchordoquy dan Molina, 2007 ) dan dibahas secara rinci, bersama dengan rincian penggunaan freezer bebas es untuk menyimpan DNA dan reagen lainnya, dalam Lampiran 1. Kualitas air sering menjadi masalah, dan jika dapat diandalkan Milli-Q (MilliporeSigma, Burlington, Massachusetts, USA) atau air yang setara tidak tersedia, disarankan untuk membeli air tingkat biologi molekuler dari perusahaan reagen yang andal.

Kami memilih primer PCR untuk barcode DNA tanaman rbcL dan matK berdasarkan rekomendasi dari Kelompok Kerja Pabrik CBOL (2009). Lampiran 1 merinci urutan primer dan kondisi PCR. Kami melakukan dua reaksi PCR 12,5-μL untuk setiap sampel DNA yang diekstraksi menggunakan protokol berbasis CTAB (Gbr. 1). Dua reaksi volume kecil digunakan sebagai pengganti satu reaksi volume besar untuk memberikan dua upaya independen pada amplifikasi sambil menghemat reagen PCR yang mahal. Produk PCR diperiksa menggunakan elektroforesis gel seperti dijelaskan di atas. Jika tidak ada produk PCR yang dihasilkan setelah dua kali percobaan, tidak ada PCR lebih lanjut yang dilakukan. Namun, jika beberapa produk ada, PCR tambahan dilakukan sampai ada cukup DNA untuk diurutkan. Ada trade-off yang terkait dengan melakukan PCR tambahan untuk mendapatkan produk yang cukup vs mencoba untuk mengoptimalkan protokol PCR untuk template dan kombinasi primer yang menghasilkan hasil marjinal. Pengoptimalan mungkin tidak praktis ketika sebuah proyek, seperti dalam kasus ini, mengambil sampel individu dari seluruh wilayah atau komunitas. Namun, ketika mengambil sampel taksa yang terkait erat, pengoptimalan pada akhirnya dapat menghemat waktu dan sumber daya. Saran untuk pengoptimalan dan pemecahan masalah dapat ditemukan di Lampiran 1.

Untuk memperoleh rbcL barcode, kami melakukan hingga empat reaksi PCR pada 75 sampel DNA yang diekstraksi menggunakan protokol Wendel dan hingga enam reaksi PCR pada 386 sampel DNA yang diekstraksi menggunakan protokol Porebski (55 sampel mewakili ekstraksi dari spesimen yang sebelumnya diekstraksi dengan protokol Wendel Gambar 1) . Secara total, kami mencoba untuk menghasilkan rbcL barcode dari 406 spesimen (Lampiran S1). Kami menggunakan elektroforesis gel untuk menentukan hasil PCR, kami menetapkan hasil ke kategori kualitatif untuk menentukan sampel DNA mana yang harus menjadi target reaksi PCR tambahan untuk mengakumulasi DNA yang cukup untuk sekuensing. Kategori yang kami gunakan adalah "tidak ada produk" ketika tidak ada pita produk yang terlihat "beberapa produk" ketika pita samar dengan ukuran yang diharapkan terlihat dan "produk yang memadai" ketika pita cerah dengan ukuran yang diharapkan terlihat. Kategori ini didasarkan pada hasil empiris dari pengurutan pita samar vs. terang. Kami menggunakan kategori yang sama seperti yang dijelaskan di atas untuk mengkategorikan kumpulan DNA dari beberapa reaksi PCR untuk mengirim sampel untuk pengurutan (Gbr. 1). Terlepas dari metode ekstraksi DNA yang digunakan, kami paling sering membutuhkan tiga atau empat reaksi PCR 12,5-μL untuk mendapatkan produk PCR yang cukup untuk pengurutan. Dari 75 sampel yang diekstraksi dengan protokol Wendel, 19 diurutkan, dan dari 386 sampel yang diekstraksi dengan protokol Porebski, 76 diurutkan. Ringkasan data ini ditunjukkan pada Gambar 2. Dua spesimen selanjutnya diurutkan dengan menggabungkan produk PCR dari ekstraksi Wendel dan Porebski, menghasilkan total 97 barcode yang dihasilkan dari 406 spesimen (24%).

Untuk memperoleh matK barcode, kami melakukan hingga enam reaksi PCR pada 73 sampel yang diekstraksi menggunakan protokol Wendel dan hingga tujuh reaksi PCR pada 386 sampel yang diekstraksi menggunakan protokol Porebski (56 sampel mewakili ekstraksi dari spesimen yang sebelumnya diekstraksi dengan protokol Wendel Gambar 1). Secara total, kami mencoba untuk menghasilkan matK barcode dari 405 spesimen (Lampiran S1). Seperti dijelaskan di atas, produk PCR untuk setiap metode ekstraksi dibagi menjadi tiga kategori (tidak ada produk, beberapa produk, dan produk memadai) berdasarkan hasil yang diperkirakan dengan elektroforesis gel. Hasil PCR dirangkum dalam Gambar 2. Kami paling sering membutuhkan dua (Wendel) atau empat (Porebski) 12,5-μL reaksi PCR per sampel untuk mendapatkan produk yang cukup untuk pengurutan. Dari 73 sampel yang diekstraksi dengan protokol Wendel, 18 diurutkan, dan dari 386 sampel yang diekstraksi dengan protokol Porebski, 116 diurutkan. 10 spesimen selanjutnya diurutkan dari produk gabungan dari ekstraksi Wendel dan Porebski, menghasilkan total 144 barcode dari 405 spesimen (35%). Secara keseluruhan, metode ekstraksi DNA Wendel dan Porebski dilakukan dengan cara yang sama (Gbr. 2).

DNA yang diekstraksi menggunakan protokol QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (Lampiran 1) masing-masing dikenai reaksi PCR tunggal (Gbr. 1). Reaksi PCR tunggal dari DNA yang diekstraksi CTAB yang sesuai dilakukan pada waktu yang sama. Seperti sebelumnya, produk PCR dibagi menjadi tiga kategori (tidak ada produk, beberapa produk, produk memadai) berdasarkan hasil yang diperkirakan dengan elektroforesis gel. Keberhasilan reaksi PCR tunggal ini untuk matK dan rbcL ditunjukkan pada Gambar 3, dan rincian lengkap diberikan dalam Lampiran S1. Dalam hal DNA yang dapat digunakan untuk menghasilkan produk PCR, DNA yang diekstraksi QIAGEN memiliki kinerja yang mirip dengan DNA yang diekstraksi CTAB. Menggunakan DNA yang diekstraksi menggunakan kit QIAGEN, kami menghasilkan tambahan 18 rbcL urutan untuk memberikan total 115/406 spesimen (28%) dan 10 matK urutan untuk memberikan total 154/405 spesimen (38%). Aksesi GenBank diberikan dalam Lampiran S1.

Meskipun tingkat kegagalan PCR tampak tinggi, spesimen yang memiliki setidaknya beberapa produk PCR (Gbr. 2, Lampiran S1) kemungkinan dapat diurutkan setelah optimasi PCR untuk meningkatkan hasil. Sebanyak 51 spesimen memiliki beberapa produk PCR untuk rbcL (gabungan dari ketiga metode ekstraksi DNA). Optimalisasi PCR dan pengurutan yang berhasil akan meningkatkan tingkat keberhasilan keseluruhan menjadi 41%. Demikian pula, ada 75 spesimen untuk matK, yang jika berhasil diurutkan, akan meningkatkan tingkat keberhasilan secara keseluruhan menjadi 57%.

Seperti dibahas di atas, kelompok taksonomi tumbuhan berbeda dengan adanya senyawa yang menghambat ekstraksi dan amplifikasi DNA, dan primer universal mungkin tidak bekerja untuk semua keluarga. Oleh karena itu, kami mengharapkan keberhasilan kami secara keseluruhan bervariasi di antara keluarga tumbuhan. Kami menemukan hubungan yang signifikan dari keluarga taksonomi dengan keberhasilan keseluruhan menghasilkan barcode DNA untuk keduanya matK dan rbcL (masing-masing, χ 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 −8 χ 2 = 25.5, df = 11, P = 0,00768 Tabel 1, Lampiran S1). Penting untuk dicatat kegagalan total sampel dari Clusiaceae dan Phyllanthaceae untuk kedua penanda, dan perbedaan keberhasilan antara matK dan rbcL untuk Annonaceae dan Myristicaceae.

Keluarga A Keluarga berbeda secara signifikan dalam tingkat keberhasilan (matK: χ 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 -8 rbcL: χ 2 = 25.5, df = 11, P = 0,00768). Lihat Lampiran S1 untuk daftar lengkap keberhasilan menurut keluarga.
matK rbcL
Kode batang dihasilkan Kode batang tidak dibuat Kode batang dihasilkan Kode batang tidak dibuat
Annonaceae 18 9 1 26
Apocynaceae 7 7 3 11
Clusiaceae 0 11 1 10
Dipterocarpaceae 12 8 8 12
Lauracea 6 5 1 10
Meliaceae 7 8 6 9
Moraceae 7 14 7 14
Myristicaceae 12 2 0 14
Phyllanthaceae 1 30 7 24
Primulaceae 4 9 5 8
Rubiaceae 7 28 9 26
Lainnya 73 120 67 127
TOTAL 154 251 115 291
  • A Keluarga berbeda secara signifikan dalam tingkat keberhasilan (matK: χ 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 -8 rbcL: χ 2 = 25.5, df = 11, P = 0,00768). Lihat Lampiran S1 untuk daftar lengkap keberhasilan menurut keluarga.

Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa beberapa metode ekstraksi dapat digunakan dengan sukses, menunjukkan bahwa faktor lain, seperti biaya kit, akses ke bahan kimia dan infrastruktur yang sesuai, dan pengalaman sukses sebelumnya dengan sampel serupa, harus dipertimbangkan saat memilih metode.

Mengurangi kontaminasi

Kontaminasi dapat menjadi masalah utama di setiap laboratorium biologi molekuler.Produk PCR yang telah diamplifikasi sebelumnya menjadi perhatian khusus karena produk tersebut dapat beramplifikasi jauh lebih mudah daripada lokus target asli, yang mungkin terletak dalam fragmen panjang DNA genom. Laboratorium harus ditata sedemikian rupa sehingga meminimalkan risiko kontaminasi. Idealnya, harus ada ruangan terpisah dengan peralatan dan mikropipet terpisah untuk ekstraksi DNA vs. PCR dan semua proses pasca-PCR. Jika ini tidak memungkinkan, area laboratorium yang terpisah dengan mikropipet terpisah harus digunakan untuk ekstraksi DNA dan PCR. Ujung filter secara efektif mengurangi jumlah kontaminasi silang oleh aerosol selama pemipetan dan harus digunakan jika memungkinkan. Biaya tambahan tip filter diimbangi dengan mengurangi pembuatan data yang tidak dapat digunakan. Pipet harus dibersihkan secara teratur, dan sarung tangan baru harus dipakai setiap saat dan sering diganti. Sangat mudah bagi cairan, atau aerosol dari cairan, untuk menempel pada kulit atau sarung tangan, dan dipindahkan ke langkah pemrosesan berikutnya. Perawatan harus dilakukan saat menangani spesimen agar tidak menyebarkan fragmen daun di sekitar area kerja, atau mengontaminasi sampel. Tang untuk manipulasi sampel dapat disterilkan dengan cara dibakar atau dibersihkan dengan alkohol. Kontrol negatif (campuran reaksi lengkap tanpa cetakan DNA) harus disertakan dalam setiap rangkaian reaksi PCR untuk memungkinkan kontaminasi dideteksi dengan cepat sebelum dilakukan pengurutan yang mahal. Penyimpanan catatan rinci dalam buku log pada semua percobaan PCR sangat diperlukan untuk tugas menemukan sumber kontaminasi. Jika akses ke pemrosesan sampel otomatis tersedia, ini menghadirkan kemungkinan lebih lanjut untuk pengurangan kontaminasi serta untuk meningkatkan reproduktifitas.

Pengurutan DNA

Biaya pengurutan DNA terus menurun, dan semakin banyak layanan dan platform pengurutan yang tersedia. Pengurutan barcode dengan throughput tinggi (misalnya, Liu et al., 2017 ) dan metabarcoding (Deiner et al., 2017 ) adalah pilihan yang baik untuk proyek barcode yang menargetkan jumlah sampel dan/atau jaringan ekologis yang sangat tinggi. Bahkan sekuensing senapan seluruh genom pada cakupan rendah untuk "membaca" organel dan lokus nuklir salinan tinggi dari pembacaan sekuensing menjadi hemat biaya (Twyford dan Ness, 2017). Untuk proyek yang menargetkan sejumlah kecil kode batang dari spesimen yang berjumlah ratusan hingga beberapa ribu, pengurutan Sanger tetap merupakan pilihan yang masuk akal. Keputusan utama adalah apakah akan mengalihdayakan pengurutan kode batang yang dihasilkan PCR, atau menyelesaikannya di dalam institusi. Kami merekomendasikan outsourcing ke layanan sekuensing berkualitas tinggi dan terjangkau karena seringkali lebih murah daripada mengimpor reagen, melakukan reaksi berulang dan pemecahan masalah, dan memelihara instrumen. Layanan pengurutan juga berada dalam posisi yang jauh lebih baik daripada laboratorium individu untuk mengikuti langkah cepat perubahan teknologi dalam pendekatan pengurutan DNA. Berbagai perusahaan menawarkan pengurutan sekali jalan mulai dari US$3 per sampel. Biasanya ada diskon yang lebih besar untuk mengirimkan sampel dalam jumlah yang lebih besar dalam format piring, dan pengiriman gratis tersedia untuk mengirimkan sampel dalam jumlah yang lebih besar, namun tetap sederhana. Layanan tambahan seperti pemurnian produk PCR juga ditawarkan oleh banyak perusahaan, yang mungkin lebih hemat biaya daripada mengimpor reagen. Tidak seperti spesimen atau DNA genom, produk PCR untuk sekuensing DNA biasanya dapat dikirim ke luar negara asal karena sampel hanya sebagian kecil dari genom, yang tidak dapat digunakan untuk tujuan lain, dan reaksi sekuensing menghabiskan seluruh sampel. . Kami menggunakan layanan pengurutan Sanger di Macrogen Korea, di mana persyaratan untuk pengiriman sampel adalah 25 L produk pada 100 ng/μL, ditambah 2 L primer pengurutan pada 10 pmol/μL. Macrogen juga menawarkan opsi sintesis primer dengan harga terjangkau. Pengiriman gratis untuk lebih dari 20 reaksi, dan satu reaksi berulang gratis disediakan untuk sampel yang gagal, menjadikannya cara yang sangat hemat biaya untuk menghasilkan data urutan untuk laboratorium skala kecil.

Data sekuensing berkualitas tinggi biasanya dapat diperoleh ketika kuantitas dan standar kualitas yang sesuai terpenuhi, meskipun karakteristik sekuens tertentu (misalnya, konten GC tinggi dan adanya pengulangan sekuens sederhana) dapat mengganggu. Pedoman kuantitas dan kualitas biasanya tersedia dari layanan pengurutan, dan sumber yang sangat baik untuk memecahkan masalah jejak urutan DNA telah disediakan oleh Fasilitas Inti Penelitian PCR Asam Nukleat (Fasilitas NAPCore, Philadelphia, Pennsylvania, AS https://napcore.research. chop.edu/problems.php).


Aplikasi

Transmisi sekuensing DNA mikroskop elektron belum tersedia secara komersial, tetapi panjang bacaan yang panjang yang mungkin disediakan oleh teknologi ini suatu hari akan membuatnya berguna dalam berbagai konteks.

De novo perakitan genom

Saat mengurutkan genom, genom harus dipecah menjadi bagian-bagian yang cukup pendek untuk diurutkan dalam sekali baca. Bacaan ini kemudian harus disatukan kembali seperti teka-teki jigsaw dengan menyelaraskan daerah yang tumpang tindih antara membaca proses ini disebut de novoperakitan genom. Semakin lama panjang baca yang disediakan oleh platform pengurutan, semakin panjang daerah yang tumpang tindih, dan semakin mudah untuk merakit genom. Dari perspektif komputasi, sekuensing Sanger mikrofluida masih merupakan cara paling efektif untuk mengurutkan dan merakit genom yang tidak ada sekuens genom referensi. Panjang baca yang relatif panjang memberikan tumpang tindih yang substansial antara pembacaan sekuensing individu, yang memungkinkan kepercayaan statistik yang lebih besar dalam perakitan. Selain itu, pembacaan Sanger yang panjang dapat menjangkau sebagian besar wilayah urutan DNA berulang yang sebaliknya mengacaukan perakitan urutan dengan menyebabkan keberpihakan yang salah. Namun, de novo perakitan genom dengan sekuensing Sanger sangat mahal dan memakan waktu. Teknologi pengurutan generasi kedua, [19] meskipun lebih murah, umumnya tidak cocok untuk de novo perakitan genom karena panjang baca yang pendek. Secara umum, teknologi sekuensing generasi ketiga, [11] termasuk sekuensing DNA mikroskop elektron transmisi, bertujuan untuk meningkatkan panjang baca sambil mempertahankan biaya sekuensing rendah. Dengan demikian, seiring dengan peningkatan teknologi pengurutan generasi ketiga, cepat dan murah de novo perakitan genom akan menjadi kenyataan.

Haplotipe penuh

Haplotipe adalah serangkaian alel terkait yang diwarisi bersama pada satu kromosom. Sekuensing DNA dapat digunakan untuk genotipe semua polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) yang merupakan haplotipe. Namun, pembacaan sekuensing DNA pendek seringkali tidak dapat dilakukan secara bertahap yaitu, varian heterozigot tidak dapat dengan yakin ditetapkan ke haplotipe yang benar. Faktanya, haplotyping dengan data sekuensing DNA yang dibaca pendek membutuhkan cakupan yang sangat tinggi (cakupan rata-rata >50x dari setiap basis DNA) untuk mengidentifikasi SNP secara akurat, serta data sekuens tambahan dari orang tua sehingga transmisi Mendel dapat digunakan untuk memperkirakan haplotipe. [20] Teknologi sekuensing yang menghasilkan pembacaan panjang, termasuk sekuensing DNA mikroskop elektron transmisi, dapat menangkap seluruh haploblock dalam sekali baca. Artinya, haplotipe tidak dipecah di antara banyak pembacaan, dan alel yang terkait secara genetik tetap bersama dalam data pengurutan. Oleh karena itu, membaca panjang membuat haplotyping lebih mudah dan lebih akurat, yang bermanfaat bagi bidang genetika populasi.

Salin varian nomor

Gen biasanya hadir dalam dua salinan dalam gen genom manusia diploid yang menyimpang dari nomor salinan standar ini disebut sebagai varian nomor salinan (CNV). Variasi nomor salinan bisa jinak (ini biasanya varian umum, disebut polimorfisme nomor salinan) atau patogen. [21] CNV dideteksi oleh hibridisasi fluoresensi in situ (FISH) atau hibridisasi genomik komparatif (CGH). Untuk mendeteksi breakpoint spesifik di mana penghapusan terjadi, atau untuk mendeteksi lesi genomik yang ditimbulkan oleh peristiwa duplikasi atau amplifikasi, CGH dapat dilakukan menggunakan susunan ubin (array CGH), atau wilayah varian dapat diurutkan. Pembacaan sekuensing panjang sangat berguna untuk menganalisis duplikasi atau amplifikasi, karena memungkinkan untuk menganalisis orientasi segmen yang diperkuat jika ditangkap dalam satu pembacaan sekuensing.

Kanker

Genomik kanker, atau onkogenomik, adalah bidang yang sedang berkembang di mana teknologi sekuensing DNA generasi kedua throughput tinggi sedang diterapkan untuk mengurutkan seluruh genom kanker. Menganalisis data pengurutan baca singkat ini mencakup semua masalah yang terkait dengan de novo perakitan genom menggunakan data baca singkat. [22] Selanjutnya, genom kanker sering aneuploid. [23] Penyimpangan ini, yang pada dasarnya adalah varian nomor salinan skala besar, dapat dianalisis dengan teknologi pengurutan generasi kedua menggunakan frekuensi baca untuk memperkirakan jumlah salinan. [22] Pembacaan yang lebih lama akan, bagaimanapun, memberikan gambaran yang lebih akurat tentang nomor salinan, orientasi daerah yang diperkuat, dan SNP yang ada dalam genom kanker.

Urutan mikrobioma

Mikrobioma mengacu pada koleksi total mikroba yang ada dalam lingkungan mikro dan genomnya masing-masing. Misalnya, diperkirakan 100 triliun sel mikroba menjajah tubuh manusia pada waktu tertentu. [24] Mikrobioma manusia sangat menarik, karena bakteri komensal ini penting untuk kesehatan dan kekebalan manusia. Sebagian besar genom bakteri bumi belum diurutkan melakukan proyek sekuensing mikrobioma akan membutuhkan ekstensif de novo perakitan genom, prospek yang menakutkan dengan teknologi sekuensing DNA baca pendek. [25] Membaca lebih lama akan sangat memudahkan perakitan genom mikroba baru.


Tren Terbaru dalam Bioteknologi Hewan

Bioteknologi hewan telah didefinisikan dalam berbagai cara. Salah satu definisi bioteknologi hewan yang dikutip terbaru adalah: “Penerapan prinsip-prinsip ilmiah dan rekayasa untuk pemrosesan atau produksi bahan oleh hewan atau spesies akuatik untuk menyediakan barang dan jasa”.

Bioteknologi Hewan telah berkembang pesat sejak awal 1980-an ketika tikus transgenik pertama dan embrio sapi pertama yang diproduksi secara in vitro diciptakan.

Sebuah usaha telah dilakukan dalam artikel ini untuk menggambarkan sumber informasi dan proses yang tersedia di bidang bioteknologi hewan.

Contoh bioteknologi hewan termasuk generasi hewan transgenik atau ikan transgenik menggunakan teknologi knockout gen untuk menghasilkan hewan di mana gen tertentu telah dinonaktifkan, produksi hewan yang hampir identik dengan transfer inti sel somatik, atau produksi spesies air yang tidak subur.

Untuk memenuhi kebutuhan populasi kita yang berkembang pesat, mencari sumber protein yang murah baik dari hewan atau dari tumbuhan telah menjadi tugas yang paling menakutkan bagi kita. Protein hewani adalah sumber yang sangat baik dari asam amino makanan yang penting untuk nutrisi manusia. Selain itu, kami dapat memanen daging, susu, dan serat dari hewan hidup dan menggunakannya untuk berbagai program kesejahteraan. Produksi makanan dari hewan lebih mahal dan kurang efisien daripada tanaman. Terlepas dari kekurangan ini, kami terus memelihara hewan secara komersial untuk makanan, serat, dan produk sampingan.

Nenek moyang kita pertama kali menjinakkan hewan ribuan tahun yang lalu dan sejak itu mereka telah menjadi sahabat tetap kita. Sejak saat itu, hewan itu sendiri mulai berubah. Dengan berlalunya waktu dan isolasi lanjutan dari kerabat liar mereka, hewan peliharaan mulai menunjukkan karakteristik yang berbeda. Beberapa akan menghasilkan susu lebih banyak atau lebih baik daripada yang lain, beberapa akan tumbuh lebih cepat atau lebih subur, beberapa akan lebih kuat.

Nenek moyang kita mungkin telah memperhatikan variasi ini dan mengawinkan hewan dengan sifat yang diinginkan serupa, tetapi mereka melakukannya tanpa memahami dasar hereditas. Pembiakan terbatas dan perkawinan selektif secara bertahap menghasilkan banyak jenis ternak yang kita miliki saat ini, meskipun sebagian besar jenis ternak domestik yang dominan, Bos taurus, muncul dalam beberapa abad terakhir. Kawanan spesies leluhur, Bos primigenius, hidup di Eropa pada abad ke-18.

Dengan demikian, perbaikan hewan tidak lagi menjadi hal yang menarik tetapi merupakan kebutuhan. Bioteknologi memberi kita alat yang kuat yang melibatkan kita mempelajari dasar-dasar alat ini untuk peningkatan produksi hewan di seluruh dunia. Pada artikel ini saya akan membahas apa saja alat-alat tersebut dan aplikasinya.

A. Reproduksi pada Hewan/Teknologi Reproduksi:

Reproduksi memiliki beberapa peran penting dalam sistem produksi. Itu harus terjadi pada tingkat yang memastikan pengisian kembali stok lebih besar daripada penggunaannya dan meningkatkan kualitas genetik stok. Teknologi reproduksi bertujuan untuk meningkatkan jumlah keturunan sekaligus meningkatkan kualitas genetik ternak pada umumnya dan ternak yang dikelola secara intensif seperti sapi perah dan babi domestik pada khususnya. Ini telah dilakukan dengan berbagai prosedur seperti inseminasi buatan, transfer embrio, fertilisasi in vitro dan kloning embrio.

A. 1. Inseminasi Buatan (AI):

Inseminasi buatan, bioteknologi hewan pertama, memanfaatkan kelebihan kapasitas produksi gamet (sperma) jantan. Ini telah menjadi faktor tunggal yang paling penting dalam meningkatkan produktivitas. Ada banyak variasi inseminasi buatan yang perlu dipertimbangkan. Ada inseminasi buatan hewan-hewan, inseminasi semen segar (dingin) dan inseminasi semen beku.

Sebelum inseminasi sperma ejakulasi dikumpulkan, diencerkan dan diperiksa di bawah mikroskop untuk menentukan jumlah dan kematian sperma. Teknik AI meliputi deposisi vagina, implan bedah, dan inseminasi trans-serviks. Studi telah dipublikasikan dengan bukti yang meyakinkan bahwa setiap persiapan semen segar, segar diperpanjang atau beku akan menghasilkan liter yang lebih besar jika semen disimpan ke dalam rahim, terutama dengan teknik trans-serviks. Semen segar dan segar diperpanjang menghasilkan hasil yang baik dengan deposisi vagina.

Untuk sapi, AI dilakukan pada hewan berdiri tanpa menggunakan anestesi, menggunakan prosedur yang dikenal sebagai “palpasi rektal”. Dari berbagai jenis sediaan semen, jelas sekali lagi bahwa pengumpulan dan inseminasi hewan-hewan segar akan memberikan sediaan semen yang terbaik. Semen segar atau “dingin” telah bekerja dengan sangat baik selama bertahun-tahun, tetapi tidak sebaik semen segar.

Hasil terburuk adalah dengan semen beku, tidak peduli proses apa yang digunakan untuk pembekuan. Betina diinseminasi setelah ovulasi, yang berlangsung hanya beberapa jam dan paling sering terjadi pada malam hari. Pada banyak ras hewan ternak, sangat sulit untuk mendeteksi ovulasi (berahi).

Alternatifnya adalah mendorong betina untuk berovulasi dengan cara yang sinkron. Dalam praktiknya, agak tidak mungkin untuk mencapai sinkronisasi total ovulasi tetapi sekitar 80% wanita akan merespons penginduksi. Pada ternak ruminansia, ovulasi pada betina dapat diinduksi dengan pemberian hormon seperti progesteron atau prostaglandin.

Jenis kelamin tunggal sedang disukai oleh semua industri peternakan. Pada sapi perah dan sapi potong, betina lebih diterima daripada jantan karena betina tidak efisien dalam reproduksi dan memiliki sifat produksi yang diinginkan. Hal yang sama terjadi di industri babi. Jenis kelamin embrio ditentukan semata-mata oleh sperma yang mengandung kromosom X atau kromosom Y.

Karena separuh sperma dalam ejakulasi mengandung X dan separuh sisanya Y, rasio jenis kelamin keturunan mendekati 1 : 1. Memisahkan sperma yang mengandung kromosom X dari kromosom Y akan memungkinkan kita untuk memanipulasi keturunan seks dengan AI. Pemisahan kedua populasi telah dilakukan menggunakan penyortir sel teraktivasi fluoresen (FACS). Metode ini sangat mahal dan juga sangat lambat. Antibodi monoklonal yang mengikat secara khusus pada sel sperma yang mengandung Y dapat digunakan di masa depan untuk memisahkan sperma yang mengandung Y dan yang mengandung X. Pemilahan aliran sel sperma untuk memisahkan X dari sel pembawa Y telah berhasil dalam banyak kasus yang diuji dan pada sapi dan babi telah menghasilkan keturunan dengan jenis kelamin yang diinginkan.

A. 2. Perpindahan Embrio:

Perbanyakan hewan yang bernilai genetik ditingkatkan dengan mentransfer embrio. Untuk melakukan ini, seseorang harus meningkatkan jumlah telur matang yang dihasilkan oleh betina terpilih. Setelah pembuahan, telur yang telah dibuahi ditanamkan ke ibu angkat, satu untuk setiap telur. Wanita donor disuntik dengan prostaglandin F2a (PGF2a) untuk menginduksi estrus yang tersinkronisasi sebelum pengobatan dimulai. Sepuluh hari setelah periode estrus mereka disuntik dengan FSH selama empat hari, diikuti oleh PGF2a untuk menginduksi estrus.

Donor superovulasi kemudian dikawinkan dengan inseminasi buatan. Enam sampai delapan hari setelah inseminasi, telur yang telah dibuahi diambil dari sapi dan enam hari dari domba dan kambing. Mereka segera ditransfer ke penerima yang disinkronkan. Atau, mereka dapat dibekukan untuk penyimpanan tidak terbatas. Dengan praktik yang baik, angka kebuntingan 50-60% dapat dicapai pada sapi dari embrio yang ditransfer.

Tingkat keluaran kehamilan dapat ditingkatkan dengan metode pemisahan embrio yang menghasilkan kembar identik. Baru-baru ini ini telah menjadi alat produksi rutin, membutuhkan peralatan mikromanipulasi dan pelatihan minimal. Embrio diperoleh dari donor pada tahap blastokista (Gbr. 21.1) dan dipindahkan ke media kultur sel standar yang mengandung sukrosa hipertonik dan albumin serum sapi.

Embrio kemudian dipindahkan ke Petridish plastik berisi media kultur standar, di mana ia tenggelam ke dasar dan menempel padanya. Itu terjadi karena interaksi elektrostatik antara muatan negatif yang diinduksi BSA pada membran luar dan muatan positif dari cakram plastik.

Embrio kemudian dibelah dua menggunakan mikromanipulator yang dilengkapi dengan pisau halus di bawah mikroskop terbalik. Selama pembelahan embrio, perawatan harus dilakukan untuk memastikan bahwa massa sel dalam dibagi menjadi dua bagian yang sama. Setelah membelah, mereka dipindahkan ke saluran telur wanita penerima mengikuti prosedur yang sama seperti untuk transfer normal. Biopsi rutin telah dilakukan untuk menentukan jenis kelamin keturunan, suatu sifat produksi. Kehadiran DNA kromosom Y dalam sel-sel dari biopsi embrio menunjukkan bahwa embrio adalah laki-laki: jika tidak ada DNA kromosom Y, itu adalah perempuan. Ini sedang dilakukan dengan menggunakan PCR untuk mengamplifikasi DNA spesifik kromosom Y.

A. 3 Fertilisasi In Vitro (IVF):

Transfer embrio tidak digunakan secara luas karena banyak faktor termasuk biaya tinggi, kesulitan teknis dan ketersediaan terbatas. Kita dapat mengatasi masalah ini jika oosit, yang dikumpulkan dari wanita donor, dibuahi secara in vitro. Ini akan memastikan pembuahan lebih banyak telur menggunakan lebih sedikit air mani. Jadi IVF adalah metode yang lebih efisien daripada AI. Selama siklus estrus sejumlah folikel Graaf mulai tumbuh.

Akhirnya salah satu folikel matang dan pecah, melepaskan telur untuk pembuahan. Oosit diambil dari folikel ini dari donor superovulasi dengan operasi laparoskopi. Telur kemudian diinkubasi untuk dimatangkan dan dibuahi secara in vitro. Metode ini menuntut keterampilan teknis yang tinggi dan, oleh karena itu, tidak selalu hemat biaya.

Keberhasilan IVF tergantung pada pengumpulan sejumlah besar oosit dan pematangan di sana secara in vitro. Ini dapat dilakukan dengan mengeluarkan ovarium dari betina yang dipilih dan diinduksi untuk matang secara in vitro. Sejumlah ilmuwan di seluruh dunia telah melakukan penelitian tentang pematangan oosit secara in vitro. Namun, mungkin perlu disebutkan di sini bahwa sebagian besar folikel Graaf tidak pernah mencapai kematangan. Tingkat keberhasilan tertinggi dengan transfer embrio dilaporkan ketika blastokista ditanamkan ke penerima.

Hal ini dapat dilakukan jika embrio dipelihara dalam kultur. Banyak laboratorium telah menunjukkan bahwa 60% embrio sapi IVF dapat dibiakkan hingga tahap blastokista. Tingginya tingkat aborsi dicatat dari embrio kultur selama dua bulan pertama kehamilan. Ini mungkin karena cacat genetik pada oosit dan atau sperma pembuahan dan mutagenesis lingkungan telur, sperma atau embrio (terutama disebabkan oleh radikal bebas oksigen).

B. Kloning:

Aplikasi lain dari bioteknologi hewan adalah penggunaan transfer nuklir somatik untuk menghasilkan banyak salinan hewan yang hanya merupakan salinan identik dari hewan lain. Proses ini disebut ‘kloning’. Jadi kloning adalah produksi satu atau lebih tanaman atau hewan identik yang secara genetik identik dengan tanaman atau hewan lain.

Ini akan memfasilitasi peningkatan produksi jumlah satu embrio tertentu yang memiliki karakteristik yang diinginkan. Alam sendiri adalah agen kloning terbesar. Pada sekitar satu dari setiap 75 pembuahan, embrio yang dibuahi membelah dan menghasilkan kembar monozigot.

B. 1. Kloning DNA:

Untuk melakukan manipulasi dan analisis lebih lanjut dari molekul DNA rekombinan individu (misalnya DNA yang mengandung gen insulin), kita harus memiliki banyak salinan molekul, biasanya dalam bentuk murni. Kloning DNA adalah teknik untuk menghasilkan sejumlah besar segmen DNA spesifik. Segmen DNA yang akan dikloning dimasukkan ke dalam vektor, yang merupakan kendaraan untuk membawa DNA yang disisipkan ke dalam sel inang yang sesuai, seperti bakteri E. coli.

Vektor berisi urutan yang memungkinkan untuk direplikasi dalam sel inang dan biasanya disebut sebagai vektor kloning. Ada banyak vektor kloning yang digunakan saat ini dan pilihan di antaranya tergantung pada ukuran fragmen DNA yang perlu dikloning atau penggunaan kloning yang akan diletakkan.

Plasmid bakteri adalah molekul DNA melingkar kecil yang berbeda dari kromosom bakteri utama. Mereka mereplikasi DNA mereka secara independen dari kromosom bakteri. Plasmid yang secara rutin digunakan sebagai vektor adalah yang membawa gen resistensi obat. Gen resistensi obat berguna karena fenotipe resisten obat dapat digunakan untuk memilih sel-sel yang mengandung plasmid rekombinan.

Proses dimana sel bakteri mengambil DNA dari medium disebut transformasi. Ini membentuk dasar untuk mengkloning plasmid dalam sel bakteri (Gbr. 21.2). Dalam metode yang paling umum digunakan, plasmid rekombinan ditambahkan ke kultur bakteri yang telah diberi perlakuan sebelumnya dengan ion Kalsium. Sel bakteri kemudian diaktifkan (dengan kejutan panas) untuk mengambil DNA dari medium.

Biasanya sejumlah kecil sel dapat mengambil dan mempertahankan salah satu molekul plasmid rekombinan. Setelah sel bakteri mengambil plasmid rekombinan dari medium, sel tersebut membentuk koloni sel yang mengandung molekul DNA rekombinan. Bakteri ini mengandung plasmid rekombinan yang dipilih dari yang lain dengan menumbuhkan sel dengan adanya antibiotik spesifik untuk gen resistensi obat dari plasmid.

B.1b. Vektor Bakteriofag:

Ada berbagai kelas vektor bakteriofag, tergantung pada apakah DNA kromosom di dalam bakteriofag beruntai tunggal atau beruntai ganda dan ukuran sisipan DNA donor.

B.1c. Bakteriofag (Lambda):

Ini digunakan sebagai vektor kloning untuk sisipan DNA untai ganda hingga sekitar 25 kb. Kepala fag Lambda menyimpan DNA linier (genom) dengan panjang sekitar 50 kb. Bagian tengah genom tidak diperlukan untuk replikasi atau pengemasan sehingga bagian tengah dapat dipotong dengan menggunakan enzim restriksi dan dibuang.

Dua ‘lengan’ yang tersisa di kedua ujung genom diikat ke DNA donor yang dicerna secara restriksi (Gbr. 21.3). Molekul rekombinan dapat dimasukkan ke dalam E. coli melalui transformasi. Begitu berada di dalam bakteri, sisipan DNA donor diperkuat bersama dengan DNA lambda/fag dan dikemas menjadi partikel virus generasi baru, yang dilepaskan ketika sel dilisiskan. Partikel yang dilepaskan menginfeksi sel baru. Hal ini menyebabkan terjadinya tempat yang jelas (atau plak) di piring bakteri di tempat infeksi. Setiap plak menyimpan jutaan partikel besar, masing-masing membawa satu salinan dari sisipan DNA donor yang sama.

B. 1d. Vektor untuk Sisipan DNA yang Lebih Besar:

Ukuran maksimum DNA donor yang dapat disisipkan ke dalam plasmid atau vektor standar panjangnya sekitar 30 kb. Untuk memenuhi permintaan ini, beberapa vektor telah direkayasa. Sisipan prokariotik terbesar menggunakan sistem vektor BAC (kromosom buatan bakteri). Ini didasarkan pada plasmid F 7-kb dan memiliki kemampuan untuk menerima sisipan DNA yang lebih besar (hingga sekitar 300 kb).

Untuk sisipan yang lebih besar dari 300 kb, YAC (kromosom buatan ragi) — sistem vektor eukariotik berdasarkan kromosom ragi yang dimasukkan ke dalam sel ragi melalui transformasi, digunakan untuk mengkloning molekul rekombinan dengan panjang 1.000 kb.

B. 1e. Pembentukan Perpustakaan DNA:

Kloning DNA sering digunakan untuk menghasilkan perpustakaan DNA, yang merupakan kumpulan fragmen DNA kloning. Ada dua tipe dasar perpustakaan DNA: perpustakaan genom dan perpustakaan cDNA. Pustaka genom dihasilkan dari total DNA yang diperoleh dari inti dan berisi semua urutan DNA spesies.

Setelah perpustakaan genom suatu spesies dibuat, para ilmuwan dapat menggunakan perpustakaan tersebut untuk mengisolasi segmen DNA tertentu. Pustaka cDNA berasal dari salinan DNA populasi mRNA. Pustaka cDNA dihasilkan dari mRNA yang ada dalam jenis sel tertentu dan ini sesuai dengan gen yang aktif dalam jenis sel tersebut.

B.1f. Identifikasi Molekul DNA yang Diinginkan:

Segera setelah kloning, tugas selanjutnya adalah menemukan kloning tertentu yang mengandung gen yang diinginkan. Ini telah dilakukan baik dengan menggunakan probe tertentu (untuk menemukan DNA atau protein) atau dengan menyelidiki asam nukleat tertentu.

B.1g. Penggunaan Teknologi DNA Rekombinan untuk Rekayasa Genetika:

Penggunaan teknik DNA rekombinan yang canggih untuk mengubah genotipe dan fenotipe suatu organisme disebut rekayasa genetika. Ini dilakukan dengan memasukkan gen ke dalam sel eukariotik, di mana mereka ditranskripsi dan diterjemahkan. Ada sejumlah strategi untuk mencapai ini. Teknik yang paling sering digunakan adalah transfer gen yang dimediasi virus, yang disebut transduksi.

Di sini DNA yang direkayasa dimasukkan ke dalam genom virus yang tidak bereplikasi dan memungkinkan virus menginfeksi sel. Ini adalah jenis virus yang akan menentukan apakah gen yang diinginkan dapat diekspresikan sementara atau diintegrasikan ke dalam genom sel inang. Retrovirus telah digunakan dalam terapi gen untuk mentransfer gen normal ke dalam sel pasien yang memiliki gen yang rusak. Transfeksi adalah proses di mana DNA telanjang dapat dimasukkan ke dalam sel yang dikultur.

Selama proses, sel diperlakukan dengan kalsium fosfat atau DEAE-dekstran, keduanya membentuk kompleks dengan DNA tambahan yang mendorong perlekatannya ke sel. Diamati bahwa hanya beberapa sel yang mengambil DNA dan menggabungkannya secara stabil ke dalam kromosom untuk membuat eukariota transgenik (Gbr. 21.4). Elektroporasi dan lipofeksi—dua metode lain juga telah digunakan untuk mentransfeksi sel.

Dalam lipofeksi, DNA asing mengikat lipid bermuatan positif (liposom) yang mampu menyatu dengan lapisan ganda lipid dari membran sel dan memasok DNA ke sitoplasma. Dalam elektroporasi, DNA asing menemukan jalan mereka melalui membran plasma yang dimodifikasi, yang diinduksi oleh arus listrik, ke dalam nukleus dan menjadi terintegrasi ke dalam genom. DNA asing juga dapat dimasukkan ke dalam sel dengan menyuntikkan mikro langsung ke dalam inti sel.

Untuk waktu yang lama oosit Xenopus telah digunakan untuk mempelajari ekspresi gen asing. Ini berisi semua bahan untuk sintesis mRNA. Ketika DNA asing dikirim ke dalam nukleus, ia memulai transkripsi dan akhirnya m-RNA diangkut ke sitoplasma, di mana mereka diterjemahkan menjadi protein yang dapat dideteksi secara imunologis.

Target penting lainnya untuk DNA yang disuntikkan adalah nukleus embrio tikus. Di sini DNA asing menjadi terintegrasi ke dalam kromosom telur, yang akan diteruskan ke semua sel embrio dan akhirnya ke dewasa. Hewan-hewan yang telah direkayasa genetika disebut hewan transgenik.

Hewan transgenik pertama diciptakan oleh Ralph Brinster dari University of Pennsylvania dan Richar Palmiter dari University of Washington pada tahun 1981. Mereka berhasil memperkenalkan gen untuk hormon pertumbuhan tikus (GH) ke dalam telur tikus yang telah dibuahi. DNA yang disuntikkan dibangun sedemikian rupa sehingga gen GH tikus (protein pengkode) terletak di hilir dari wilayah promotor gen metallothionein tikus.

Pada tikus normal, sintesis gen metallothionein dipercepat setelah perlakuan logam seperti kadmium, seng, atau hormon glukokortikoid. Pada tikus transgenik, sintesis gen GH terlihat meningkat setelah pengobatan dengan logam dan glukokortikoid. Tikus adalah model yang paling penting untuk genetika mamalia. Teknologi yang dikembangkan pada tikus dapat diterapkan pada manusia.

Ada dua strategi untuk transgenesis pada tikus: penyisipan ektopik dan penargetan gen. Prosedur yang terlibat dalam penyisipan ektopik hanya dengan menyuntikkan larutan DNA hasil kloning bakteri ke dalam inti embrio tahap awal, yang telah dibahas sebelumnya. Penargetan gen adalah peristiwa yang agak langka dan proses multi-langkah diperlukan yang melibatkan penggunaan sel induk embrionik. Sel induk embrio (ES) memiliki kemampuan untuk membentuk setiap dan semua bagian dari tikus, itulah sebabnya mereka disebut sel totipoten.

Proses penargetan gen dapat dikenali dengan salah satu outputnya, yaitu substitusi gen nonfungsional ke gen normal. Jenis inaktivasi yang ditargetkan ini disebut knockout gen. Di sini sel induk embrionik diisolasi dari strain tikus (albino) dan embrio ditransfeksi dengan sisipan DNA yang mengandung alel mutan gen yang tidak aktif untuk dihilangkan.

Sel-sel ES kemudian disuntikkan ke embrio tikus muda penerima (blastocoel) yang dikumpulkan dari galur albino. Pada langkah berikutnya, embrio yang mengandung sel ES tumbuh menjadi ibu pengganti. Keturunan yang dihasilkan adalah chimeric, memiliki jaringan yang berasal dari strain donor (ES yang ditransplantasikan) dan penerima. Tikus chimeric kemudian dikawinkan dengan saudaranya untuk menghasilkan tikus homozigot dengan knock-out di setiap salinan gen (Gbr. 21.5). Ini adalah tikus knock-out yang tidak memiliki salinan gen yang berfungsi.

Istilah ‘kloning’ biasanya mengacu pada tiga prosedur yang berbeda. Tiga jenis kloning adalah: kloning embrio, kloning DNA dewasa, dan kloning terapeutik.

B. 2. Kloning Embrio:

Ini mungkin lebih tepat disebut ‘buatan melilit’ karena merangsang mekanisme dimana kembar berkembang secara alami. Ini melibatkan menghilangkan satu atau lebih sel dari embrio dan mendorong sel untuk berkembang menjadi embrio terpisah dengan DNA yang sama seperti aslinya.

Ini telah berhasil dilakukan selama bertahun-tahun pada banyak spesies hewan termasuk sapi, domba, babi, kambing, kuda, tahi lalat, kucing, tikus dan tikus. Teknologi kloning embrio dilakukan dengan dua cara yaitu transfer nukleus dan sel punca embrionik. Kloning embrio telah digunakan pada tikus sejak akhir 1970-an dan pembiakan hewan sejak 1980-an.

B.2a. Transfer Nuklir:

Teknik ini melibatkan kultur sel somatik dari jaringan yang sesuai (lebih disukai fibroblas) dari hewan yang akan dikloning. Nukleus dari sel somatik yang dikultur kemudian disuntikkan secara mikro ke dalam oosit enukleasi yang diperoleh dari individu lain dalam spesies yang sama atau berkerabat dekat.

Melalui proses yang belum dipahami, nukleus dari sel somatik diprogram ulang menjadi pola ekspresi gen yang cocok untuk mengarahkan perkembangan normal embrio. Setelah kultur dan pengembangan lebih lanjut secara in vitro, embrio dipindahkan ke betina penerima, dan, pada akhirnya, akan menghasilkan keturunan hidup.

Tingkat keberhasilan memproduksi hewan dengan transfer nuklir kurang dari 10% dan tergantung pada banyak faktor termasuk spesies yang terlibat, sumber ovum penerima, jenis sel inti donor, pengobatan sel donor sebelum transfer inti dan teknik yang digunakan untuk transfer nuklir.

Kloning manusia pertama yang diumumkan secara publik dilakukan oleh Robert J. Stillman dan timnya di George Washington Medical Center di Washington D.C. Mereka mengambil 17 embrio manusia yang cacat secara genetik. Embrio ini berasal dari sel telur yang telah dibuahi oleh dua sperma. Ini telah menghasilkan satu set kromosom ekstra yang merusak nasib sel telur. Tidak ada yang bisa berkembang menjadi janin. Sel telur ini berhasil dipecah pada tahun 1994, masing-masing menghasilkan satu atau lebih klon.

B. 3. Kloning DNA Dewasa (Kloning Reproduksi):

Teknik ini digunakan untuk menghasilkan duplikat dari hewan yang ada. Ini telah digunakan untuk mengkloning domba dan mamalia lainnya. Kloning reproduksi sebelumnya dianggap mustahil di semua mamalia sampai diaktifkan pada tahun 1996 oleh seorang ilmuwan, Dr. Ian Wialmut dari Institut Roslin di Roslin, Skotlandia, Inggris “Dolly”, domba berumur tujuh bulan, ditampilkan kepada media pada 23 Februari 1997. Dia adalah hewan kloning besar pertama yang menggunakan DNA dari orang dewasa lain.

Sebuah sel diambil dari jaringan susu domba dewasa berumur enam tahun ketika DNA-nya dalam keadaan tidak aktif. Itu menyatu dengan sel telur domba yang intinya dihilangkan. Sel ‘dibuahi’ kemudian dirangsang dengan pulsa listrik. Dari 277 upaya fusi sel, hanya 29 yang mulai membelah. Ini semua ditanamkan pada domba betina, 13 menjadi hamil tetapi hanya satu domba, Dolly, yang dilahirkan. Pada tanggal 4 Maret 1997, Presiden Clinton memerintahkan larangan luas pada pendanaan Federal untuk kloning manusia di AS. Penelitian tentang kloning manusia terus berlanjut di negara lain.

Selama 25 tahun terakhir kemajuan luar biasa telah dibuat dalam analisis genom eukariotik. Kemajuan ini dimulai ketika ahli biologi molekuler belajar untuk membangun molekul DNA rekombinan, yang merupakan molekul yang mengandung urutan DNA yang berasal dari lebih dari satu sumber.

Ini melibatkan isolasi dari genom segmen tertentu DNA yang mengkode polipeptida tertentu, isolasi enzim yang akan memotong DNA di lokasi yang ditentukan secara tepat (endonuklease restriksi) dan enzim yang akan bergabung secara kovalen dengan fragmen DNA (ligase).

Langkah-Langkah Utama Kloning DNA diberikan pada (Gbr. 21.6) dan Melibatkan Prosedur Berikut:

1. Isolasi DNA yang akan dikloning.

2. Penyisipan DNA hasil isolasi ke dalam potongan DNA lain yang disebut vektor, yang merupakan kendaraan untuk membawa DNA asing ke dalam sel inang yang sesuai seperti bakteri E. coli. Meskipun (Gbr. 21.2). menunjukkan penggunaan vektor plasmid, jenis vektor lain, juga dapat digunakan seperti lambda Bacteriophage.

3. Pemindahan vektor-vektor rekombinan dalam sel bakteri baik melalui transformasi melalui infeksi menggunakan virus.

4. Pemilihan sel-sel yang mengandung vektor rekombinan yang diinginkan.

5. Pertumbuhan bakteri untuk memberikan DNA kloning sebanyak yang dibutuhkan.

B.3a. Isolasi DNA yang akan Dikloning:

Organisme yang diteliti, yang akan digunakan untuk mendonorkan DNA untuk analisis, disebut organisme donor. Tiga sumber segmen DNA dapat dipertimbangkan: DNA genomik, DNA komplementer dan DNA yang disintesis secara kimia.

Urutan DNA ini ada dalam kromosom organisme yang diteliti dan dengan demikian merupakan sumber DNA yang paling mudah.

DNA komplementer (cDNA):

DNA komplementer atau cDNA, pada dasarnya adalah versi DNA untai ganda dari molekul mRNA. cDNA dibuat dari mRNA dengan menggunakan enzim khusus yang disebut reverse transcriptase, awalnya diisolasi dari retrovirus. Dengan menggunakan molekul mRNA sebagai template, reverse transcriptase mensintesis molekul DNA untai tunggal yang dapat digunakan sebagai template untuk sintesis DNA untai ganda. Sintesis cDNA sangat penting dalam analisis struktur gen dan ekspresi gen (Gbr. 21.6).

DNA yang Disintesis secara Kimia:

Teknik untuk sintesis kimia oligonukleotida telah dikembangkan untuk menghasilkan urutan DNA untuk tujuan DNA rekombinan.

B.3b. Konstruksi DNA Rekombinan:

Molekul DNA yang terisolasi dipecah menjadi fragmen kecil dengan mencernanya secara enzimatik dengan endonuklease (enzim restriksi) yang membelah di tempat tertentu. Enzim restriksi memotong sekuens target DNA spesifik (melibatkan 4 hingga 8 nukleotida) dan sifat ini adalah salah satu fitur utama yang membuatnya cocok untuk manipulasi DNA.

Ini murni, kebetulan, setiap molekul DNA, baik yang berasal dari virus, bakteri, tumbuhan dan hewan, mengandung situs target enzim restriksi. Dengan demikian, dengan adanya enzim restriksi yang sesuai, DNA akan dipotong menjadi satu set fragmen kecil sesuai dengan lokasi situs restriksi.

Enzim Pembatasan EcoR1 (dari E. coli) Mengenali Urutan 6-Nukleotida-Pasangan berikut dalam DNA Setiap Organisme :

Jenis segmen ini disebut palindrom DNA, yang berarti bahwa kedua untai memiliki urutan nukleotida yang sama tetapi dalam orientasi antiparalel. EcoR1 mengenali dan memotong hanya dalam urutan palindrom GAATTC.

Pemotongan antara Nukleotida G dan A pada Setiap Untaian Palindrom:

Potongan terhuyung-huyung ini meninggalkan sepasang untaian tunggal ‘ujung lengket’ yang identik. Ujung-ujungnya disebut lengket karena, sebagai untai tunggal, mereka dapat dihibridisasi melalui ikatan hidrogen pasangan basa ke salinan komplementer. Produksi ujung lengket ini adalah fitur lain dari banyak enzim restriksi yang menjadikannya alat yang cocok untuk teknologi DNA rekombinan.

Jika dua molekul DNA dipotong dengan enzim restriksi penghasil ujung lengket yang sama, fragmen masing-masing akan memiliki ujung lengket komplementer yang sama, memungkinkan mereka untuk berhibridisasi satu sama lain di bawah kondisi yang sesuai dalam tabung reaksi. (Gbr. 21.7). menggambarkan enzim restriksi membuat potongan tunggal pada molekul DNA melingkar seperti plasmid (vektor) potongan membuka lingkaran, dan molekul liner yang dihasilkan memiliki dua ujung lengket.

Jika molekul tersebut dicampur dengan molekul DNA yang berbeda (fragmen DNA donor yang mengandung insulin—pemotongan gen dengan EcoR1, seperti yang ditunjukkan pada (Gbr. 21.7), keduanya kemudian dapat berhibridisasi satu sama lain melalui ujung lengket komplementer untuk membentuk molekul rekombinan. Ada dua alasan mengapa DNA donor yang mengandung gen insulin harus dilekatkan pada segmen DNA plasmid untuk membentuk molekul rekombinan yang berguna.

Pertama, segmen DNA donor yang terfragmentasi tidak memiliki urutan DNA yang diperlukan sendiri, untuk memungkinkannya direplikasi dalam tabung reaksi atau di dalam organisme inang. DNA donor harus secara fisik melekat pada segmen DNA lain yang dapat mendukung replikasi dalam tabung reaksi atau di dalam sel inang. Kedua, sebuah eksperimen mungkin menuntut beberapa fragmen direkatkan bersama untuk membentuk unit fungsional (misalnya gen yang aktif secara transkripsi).

Paling umum, baik DNA donor dan plasmid dicerna bersama dengan adanya DNA ligase. Selama inkubasi, dua jenis DNA menjadi hidrogen yang terikat satu sama lain dengan ujung lengketnya dan kemudian diikat untuk membentuk rekombinan DNA sirkular.

B. 4. Kloning Terapi:

Ini adalah prosedur yang tahap awalnya identik dengan kloning DNA dewasa. Namun, sel induk dikeluarkan dari pra-embrio dengan tujuan memproduksi jaringan atau seluruh organ untuk ditransplantasikan kembali ke orang yang memasok DNA. Pra-embrio mati dalam prosesnya. Tujuan dari kloning terapeutik adalah untuk menghasilkan salinan kesehatan dari jaringan atau organ orang sakit untuk transplantasi.

Jaringan atau organ, akan memiliki DNA asli orang sakit dan, oleh karena itu, pasien tidak perlu menggunakan obat imunosupresif selama sisa hidupnya. Para ilmuwan sedang mencoba untuk membuat babi transgenik yang memiliki gen manusia. Jantung, hati, atau ginjal mereka dapat digunakan sebagai transplantasi organ pada manusia. Ini akan menyelamatkan banyak nyawa karena ribuan orang meninggal setiap tahun menunggu organ manusia.

Setelah tercapai, hewan transgenik dapat dikloning untuk menghasilkan organ sebanyak yang dibutuhkan. Para peneliti telah menghasilkan hewan transgenik biasanya untuk menghasilkan hormon manusia atau protein dalam susunya. Zat-zat ini dapat dipisahkan dari susu dan digunakan untuk mengobati penyakit manusia.

Terapi gen adalah teknik untuk mengoreksi gen yang bertanggung jawab atas perkembangan penyakit. Janji terapi gen terbukti dari uji coba pertama yang dimulai pada tahun 1989. Penyakit yang ditangani adalah defisiensi adenosine deaminase (ADA), gangguan resesif autosomal yang langka di mana tubuh kekurangan enzim rumah tangga yang berbahaya dalam sistem kekebalan tubuh.

Di sana, tidak adanya ADA mengakibatkan kematian dini limfosit T, yang mengarah ke keadaan imunodefisiensi (SCID – parah gabungan imunodefisiensi). Di National Institute of Health, peneliti AS mentransfer gen ADA normal ke dalam limfosit anak-anak yang lahir dengan kelainan tersebut.

Dalam uji coba selanjutnya, gen itu dimasukkan ke dalam sel sumsum tulang. Dalam kedua strategi tersebut, manipulasi dilakukan secara ex vivo. Pasien disuntik dengan sel darahnya sendiri yang ditransfeksi dengan gen ADA tipe liar. Secara paralel dia diberi adenosin deaminase yang diperoleh dari darah sapi. Meskipun manfaat klinis jangka panjang belum dihargai, upaya awal ini berfungsi untuk menetapkan potensi pengiriman gen sebagai strategi terapeutik (Gbr. 21.8).

Para peneliti memang Menggunakan Salah Satu dari Beberapa Pendekatan untuk Mengoreksi Gen yang Cacat:

A. Gen normal dapat dimasukkan ke lokasi nonspesifik dalam genom untuk menggantikan gen nonfungsional. Pendekatan ini paling sering dilakukan.

B. Gen abnormal dapat ditukar dengan gen normal melalui rekombinasi homolog.

C. Gen abnormal dapat diperbaiki melalui mutasi terbalik selektif, yang mengembalikan gen ke fungsi normal.

D. Regulasi (sejauh mana gen dihidupkan atau dimatikan) dari gen tertentu dapat diubah.

Dalam sebagian besar studi terapi gen, gen “normal” dimasukkan ke dalam genom untuk menggantikan gen penyebab penyakit “abnormal”. Vektor harus digunakan untuk mengirimkan gen terapeutik ke sel target pasien. Saat ini, vektor yang paling umum adalah virus yang telah diubah secara genetik untuk membawa DNA manusia normal. Virus telah mengembangkan cara untuk mengenkapsulasi dan mengirimkan gen mereka ke sel manusia secara patogen. Para ilmuwan telah mencoba memanfaatkan kemampuan ini dan memanipulasi genom virus untuk menghilangkan gen penyebab penyakit dan memasukkan gen terapeutik.

Sel target seperti sel hati atau paru pasien terinfeksi vektor virus. Vektor kemudian membongkar materi genetiknya yang mengandung gen manusia terapeutik ke dalam
sel sasaran. Generasi produk protein fungsional dari gen terapeutik mengembalikan sel target ke keadaan normal.

Ada Jumlah Vektor Terapi Gen. Beberapa Vektor tersebut adalah:

Kelas virus yang dapat membuat salinan DNA untai ganda dari genom RNA mereka. Salinan genom ini dapat diintegrasikan ke dalam kromosom sel inang. Human Immunodeficiency Virus (HIV) adalah retrovirus.

Kelas virus dengan genom DNA untai ganda yang menyebabkan infeksi pernapasan, usus, dan mata pada manusia. Virus yang menyebabkan flu biasa adalah adenovirus.

Virus Terkait Adeno:

Kelas virus DNA untai tunggal kecil yang dapat menyisipkan materi genetiknya di tempat tertentu pada kromosom 19.

Virus Herpes Simpleks:

Kelas virus DNA untai ganda yang menginfeksi tipe sel tertentu, neuron, tipe virus Herpes simpleks adalah patogen manusia umum yang menyebabkan luka dingin.

Sebuah gen diberikan pembawa buatan yang kurang lebih dalam beberapa kasus, enkapsulasi lipid, untuk memfasilitasi perjalanan melintasi membran sel pada kasus lain, manik-manik emas kecil di mana gen dilapisi sehingga dapat ditembakkan ke dalam kulit pada orang lain. , protein yang melekatkan gen.

Persyaratan Terapi Gen:

Gen (misalnya gen ADA) diidentifikasi dan dikloning. Kemudian dimasukkan ke dalam sel pasien sendiri (ex vivo), merawatnya dalam kultur jaringan dan mengembalikannya ke pasien. Itu harus dimasukkan ke dalam DNA, ditranskripsi dan diterjemahkan dengan efisiensi yang cukup sehingga jumlah enzim yang layak diproduksi.

Retrovirus digunakan sebagai vektor gen. Retrovirus memiliki beberapa keuntungan untuk memasukkan gen ke dalam sel manusia – protein selubung mereka memungkinkan virus untuk menginfeksi sel manusia. Salinan RNA dari gen ADA manusia dapat dimasukkan ke dalam genom retroviral menggunakan sel pengemasan.

Sel pengemas mengekspresikan (i) salinan RNA dari gen ADA manusia bersama dengan sinyal pengemasan (P) yang diperlukan untuk perakitan partikel virus segar dan pengulangan terbalik (R) di setiap ujung untuk membantu penyisipan salinan DNA ke dalam DNA virus. sel sasaran,

(ii) salinan RNA dari gen retroviral gag, pol dan env tetapi tanpa sinyal pengemasan sehingga gen tidak dapat digabungkan dalam partikel virus segar.

Diperlakukan dengan Dua Genom ini, Sel Pengemas Menghasilkan Tanaman Retrovirus dengan:

(i) Protein selubung yang dibutuhkan untuk menginfeksi sel target manusia,

(ii) Salinan RNA dari gen ADA manusia, lengkap dengan urutan R di setiap ujungnya

(iii) Reverse transcriptase diperlukan untuk membuat salinan gen ADA yang dapat disisipkan ke dalam DNA sel target,

(iv) Tidak ada gen (gag, pol, env) yang memungkinkan virus bereplikasi di inang barunya. Setelah virus menginfeksi sel target, RNA ini ditranskripsikan secara terbalik menjadi DNA dan dimasukkan ke dalam DNA kromosom inang.

Selain itu, ada beberapa pilihan lain untuk pengiriman gen. Metode paling sederhana adalah pengenalan langsung DNA terapeutik ke dalam sel target. Pendekatan ini terbatas dalam penerapannya karena hanya dapat digunakan pada jaringan tertentu dan membutuhkan DNA dalam jumlah besar.

Status Penelitian Terapi Gen Saat Ini:

Administrasi Makanan dan Obat-obatan (FDA) belum menyetujui terapi gen manusia untuk dijual. Terapi gen saat ini bersifat eksperimental dan belum terbukti sangat berhasil dalam uji klinis. Sedikit kemajuan telah dibuat sejak uji klinis terapi gen pertama dimulai pada tahun 1990.

Pada tahun 1999, terapi gen mengalami kemunduran besar dengan kematian Jesse Gelsinger yang berusia 18 tahun. Jesse berpartisipasi dalam uji coba terapi gen untuk defisiensi ornithine transcarboxylase (OTCD). Dia meninggal karena kegagalan beberapa organ 4 hari setelah memulai perawatan. Kematiannya diyakini dipicu oleh respons imun yang parah terhadap adenovirus.

Pukulan besar lainnya datang pada Januari 2003, ketika FDA menghentikan sementara semua uji coba terapi gen menggunakan vektor retroviral dalam sel induk darah. FDA mengambil tindakan ini setelah mengetahui bahwa anak kedua yang dirawat dalam uji coba terapi gen Prancis telah mengembangkan kondisi seperti leukemia. Baik anak maupun anak lainnya, yang mengalami kondisi serupa pada Agustus 2002, telah berhasil diobati dengan terapi gen untuk penyakit defisiensi imun kombinasi parah terkait-X (X-SCID), juga dikenal sebagai “sindrom bayi gelembung”.

Komite Penasihat Pengubah Respons Biologis FDA (BRMAC) bertemu pada akhir Februari 2003 untuk membahas kemungkinan langkah-langkah yang memungkinkan sejumlah uji coba terapi gen retroviral untuk pengobatan penyakit yang mengancam jiwa dilanjutkan dengan pengamanan yang tepat. FDA belum membuat keputusan berdasarkan diskusi dan saran dari pertemuan BRMAC.

B.4b. Masalah dengan Terapi Gen:

Sifat terapi gen yang berumur pendek—sebelum terapi gen dapat menjadi obat permanen untuk kondisi apa pun, DNA terapeutik yang dimasukkan ke dalam sel target harus tetap berfungsi dan sel yang mengandung DNA terapeutik harus berumur panjang dan stabil. Masalah dengan pengintegrasian DNA terapeutik ke dalam genom dan sifat banyak sel yang membelah dengan cepat mencegah terapi gen mencapai manfaat jangka panjang. Pasien harus menjalani beberapa putaran terapi gen.

Setiap kali benda asing dimasukkan ke dalam jaringan manusia, sistem kekebalan ditujukan untuk menyerang penyerang. Risiko merangsang sistem kekebalan dengan cara yang mengurangi efektivitas terapi gen selalu merupakan risiko potensial. Lebih lanjut, peningkatan respon imun terhadap penyerang membuat terapi gen sulit untuk diulang pada pasien.

Masalah dengan Vektor Virus:

Virus, pembawa pilihan di sebagian besar studi terapi gen, menghadirkan berbagai masalah potensial bagi pasien seperti toksisitas, respons imun dan inflamasi. Selain itu, selalu ada ketakutan bahwa vektor virus, begitu berada di dalam tubuh pasien, dapat memulihkan kemampuannya untuk menyebabkan penyakit.

Kondisi atau kelainan yang muncul dari mutasi pada satu gen adalah kandidat terbaik untuk terapi gen. Sayangnya, beberapa gangguan yang paling umum terjadi seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi, penyakit Alzheimer, radang sendi, dan diabetes disebabkan oleh efek gabungan dari variasi dalam banyak gen. Gangguan multi-genik atau multifaktorial seperti ini akan sangat sulit untuk diobati secara efektif menggunakan terapi gen.

C. Ketidakpastian dengan Bioteknologi Hewan:

Seperti halnya teknologi baru, bioteknologi hewan menghadapi berbagai ketidakpastian, masalah keamanan, dan potensi risiko. Misalnya, kekhawatiran telah dikemukakan mengenai: penggunaan gen yang tidak perlu dalam konstruksi yang digunakan untuk menghasilkan hewan transgenik, penggunaan vektor dengan potensi untuk ditransfer atau untuk berkontribusi urutan organisme lain, efek potensial dari hewan yang dimodifikasi secara genetik pada lingkungan, dampak bioteknologi terhadap kesejahteraan hewan, dan potensi masalah kesehatan manusia dan keamanan pangan untuk daging atau produk hewani yang berasal dari bioteknologi hewan. Sebelum bioteknologi hewan akan digunakan secara luas oleh sistem produksi peternakan, penelitian tambahan akan diperlukan untuk menentukan apakah manfaat bioteknologi hewan lebih besar daripada potensi risiko tersebut.


Teknik PCR: Langkah Demi Langkah

7. Tangga DNA "Membuka Ritsleting" Menjadi Dua Untaian Terpisah

D NA polimerase dan campuran keempat nukleotida ditambahkan ke tabung reaksi yang berisi sampel DNA yang diekstraksi. Ketika DNA induk (templat) untai ganda dipanaskan hingga 95 derajat Celcius, untaian individu terlepas dan terpisah satu sama lain. Tujuannya adalah untuk mereplikasi bagian dari setiap untai yang mengandung gen target menggunakan enzim DNA polimerase. Setiap untai DNA induk tunggal memiliki sifat luar biasa untuk membangun kembali untai komplementer yang hilang saat nukleotida menempel pada arah 5 prima (5') hingga 3 prima (3'). Setiap untai komplementer yang baru terbentuk (satu untuk setiap untai induk) disebut "untaian anak".

Ketika untai ganda, molekul DNA induk (tangga DNA) dipanaskan hingga 95 o C, kedua untai individu terpisah satu sama lain. DNA polimerase memfasilitasi perlekatan nukleotida komplementer untuk membangun kembali setiap untai, menghasilkan dua molekul untai ganda. P = fosfat, D = deoksiribosa, A = adenin, T = timin, G = guanin, dan C = sitosin. "Ekor" fosfat yang diperpanjang mewakili posisi 5' dari setiap untai.

Ketika untai ganda, molekul DNA induk (DNA tangga) dipanaskan sampai 95 o C, dua untai individu terpisah satu sama lain. DNA polimerase memfasilitasi perlekatan nukleotida komplementer untuk membangun kembali setiap untai, menghasilkan dua molekul untai ganda. Bagian merah muda mewakili gen target aktual yang akan direplikasi.

8. Primer Menempel Pada Salah Satu Ujung Untai DNA

Agar DNA polimerase menemukan awal dari gen target spesifik di setiap bagian DNA, segmen pendek DNA yang disebut primer harus dilekatkan (annealed) ke setiap untai DNA "induk" di hulu (menuju ujung 3') dari setiap gen. Primer tidak tumpang tindih dengan gen target, karena bersifat komplementer dengan urutan basa yang muncul tepat sebelum gen pada untai induk DNA. Untai "anak" komplementer diproduksi dalam arah 5' hingga 3'. Primer mengandung sekitar 20 basa dan telah disintesis untuk banyak gen yang umumnya diamplifikasi menggunakan teknik PCR. Mereka dapat dibeli dari perusahaan pemasok bioteknologi. Primer untuk gen tertentu ditambahkan ke dalam campuran DNA untai tunggal setelah didinginkan hingga 52-54 o C (126-129 o F).

Bagian pendek (oligonukleotida) yang disebut primer menempel di bagian hulu dari setiap gen (menuju ujung 3' untai induk "induk"). Sekarang DNA polimerase dapat mengenali awal gen dan membangun kembali untai komplementer dalam arah 5' ke 3'.

Sebuah untai ganda, induk (templat) tangga DNA membuka ritsleting dan nukleotida menempel pada masing-masing dari dua untai induk tunggal, sesuatu yang sangat menarik terjadi. Satu untai anak, yang disebut "untai utama", terbentuk terus-menerus saat nukleotida menempel pada arah 5' hingga 3'. Tapi di untai anak lainnya, yang disebut "untai tertinggal," nukleotida menempel di bagian terputus-putus. Bagian ini disebut fragmen Okazaki, dinamai ilmuwan Jepang Reiji Okazaki yang menemukannya. Karena untai tertinggal melengkapi untai utama, ujung 3'nya berlawanan dengan ujung 5' untai utama, dan sebaliknya. Satu-satunya cara untaian ini dapat memanjang dalam arah 5 'ke 3' saat molekul DNA induk membuka ritsletingnya, adalah dengan menumbuhkannya dalam beberapa bagian atau fragmen. Penemuan luar biasa ini ditunjukkan dalam ilustrasi berikut.

Ketika untai DNA induk (templat) bereplikasi, untaian anak disintesis dalam dua cara yang berbeda. Untai utama terbentuk terus menerus sebagai nukleotida tunggal menempel satu-per-satu dalam arah 5' sampai 3'. Untai lagging terbentuk secara terputus-putus saat bagian nukleotida yang telah dibentuk sebelumnya (disebut fragmen Okazaki) menempel pada arah 5' hingga 3'.

9. Telomer: Perbaikan Molekul Utama Untuk Mengakhiri Masalah Replikasi

Struktur dan fungsi DNA tentu saja merupakan dua penemuan paling signifikan yang telah merevolusi ilmu biologi. Meskipun DNA tampaknya menjadi molekul penyimpanan yang sempurna untuk informasi genetik, DNA memiliki masalah replikasi yang serius. Kromosom sel eukariotik terdiri dari DNA linier. Agar pembelahan sel terjadi, molekul DNA harus bereplikasi. Dengan kata lain, kromosom tunggal harus menjadi kromosom ganda yang terdiri dari dua kromatid. Masalahnya adalah setiap kali DNA bereplikasi, molekul baru menjadi sedikit lebih pendek. Setelah beberapa divisi berturut-turut, degradasi ini dapat mengakibatkan kehilangan gen yang serius pada ujung kromosom. Baik Alexey Olovnikov dan James Watson secara independen menggambarkan fenomena ini yang disebut "masalah replikasi akhir" pada awal 1970-an. Bahkan, "A Theory of Marginotomy" Olovnikov meramalkan bahwa hilangnya urutan terminal yang dihasilkan dari masalah replikasi akhir akan menyebabkan penuaan (Olovnikov, 1973). [James Watson dan Francis Crick menemukan struktur DNA pada tahun 1953 dan menerima Hadiah Nobel dalam bidang Kedokteran pada tahun 1962.]

Untuk mengatasi masalah replikasi masalah akhir yang menghancurkan, sel eukariotik telah mengembangkan "tutup" pelindung di ujung kromosom yang disebut telomer. Untuk penemuan mereka tentang bagaimana kromosom dilindungi oleh telomer dan enzim telomerase, Elizabeth Blackburn, Jack Szostak dan Carol Greider dianugerahi Hadiah Nobel dalam bidang Kedokteran pada tahun 2009. Dengan penelitian genetik mereka yang cerdik dan studi biokimia yang teliti, mereka tidak hanya memecahkan masalah mendasar dalam biologi tetapi juga membuka bidang penelitian baru dan memprakarsai pengembangan terapi potensial melawan proses penuaan dan kanker. Perlu dicatat di sini bahwa lebih dari 60 tahun sebelumnya, Barbara McClintock mempelajari telomer pada jagung. Pada awal 1940-an dia mengalihkan perhatiannya ke studi elemen transposable (transposon) dalam jagung, fenomena genetik luar biasa lainnya dengan implikasi medis penting pada manusia. Untuk penelitian seumur hidup tentang transposon, ia menerima Hadiah Nobel dalam Kedokteran pada tahun 1983.

Telomer adalah untaian DNA berulang (urutan basa berulang) di ujung terminal kromosom linier. Mereka memainkan peran penting dalam menjaga integritas kromosom dengan melindunginya dari degradasi dan dari fusi ujung ke ujung dengan kromosom lain. Telomer pada dasarnya adalah pelindung "tutup ujung" DNA non-coding di ujung ekstrim kromosom. Telomere telah secara metaforis dibandingkan dengan ujung tali sepatu yang menjaga agar tali tidak terurai. Setiap kali sel membelah, telomer kehilangan sejumlah kecil DNA. Akhirnya, ketika semua DNA telomer hilang, sel tidak dapat lagi membelah dan mati. Masalah replikasi akhir tidak menjadi masalah dalam sel prokariotik karena mereka memiliki molekul DNA melingkar tanpa ujung.

Berapa kali populasi sel normal dapat membelah disebut batas Hayflick, dinamai menurut penemunya Leonard Hayflick. Pada tahun 1961, Hayflick mendemonstrasikan bahwa sel-sel janin manusia normal dalam suatu kultur membelah antara 40 dan 60 kali. Sekarang jelas bahwa pembelahan sel terjadi sampai telomer mencapai panjang kritis. Perkiraan panjang telomer manusia berkisar dari 8.000 pasangan basa saat lahir hingga 3.000 seiring bertambahnya usia, dan serendah 1.500 pada orang tua. Dimulai dengan 8.000 pasangan basa, hilangnya 100 hingga 200 pada setiap divisi akan mengikis habis telomer di 40 hingga 80 divisi.

1. Saat DNA Membuka Ritsleting, DNA Polimerase Harus Menempel Pada Ujung 3' Induk Strand.
2. Itu Harus Menambahkan Nukleotida (Sintesis Daughter Strand) Dalam Arah 5' ke 3'.
3.Primer RNA Harus Melampirkan Pertama Untuk Memberikan DNA Polimerase Tempat Untuk Memulai.

Duplikasi kromosom C dimulai dengan membuka ritsleting DNA untai ganda menjadi dua untai (untai induk #1 & untai induk #2). Untaian induk komplementer ini berfungsi sebagai cetakan untuk membangun dua molekul DNA. Primer RNA menempel pada ujung 3' dari untai induk #1, sehingga memberikan DNA polimerase tempat untuk memulai. Primer menempel tepat sebelum perlekatan awal DNA polimerase. DNA polimerase bergerak dalam arah 3' sampai 5' di sepanjang untai induk #1, menambahkan nukleotida untuk membentuk untai anak DNA komplementer yang berkesinambungan sepanjang seluruh cetakan untaian induk #1. Untai komplementer ini disebut "untai utama" dan disintesis dalam arah 5' ke 3'. [5' dan 3' mengacu pada atom karbon spesifik dari gula deoksiribosa dalam blok pembangun DNA yang disebut nukleotida.] Ketika arah 5' dan 3' disebutkan, penting untuk menentukan apakah Anda mengacu pada untai induk atau untai anak komplementer. .

Karena DNA induk asli terbuka, DNA polimerase tidak dapat menempel pada bagian atas untai induk #2 pada posisi 5' (kanan atas pada diagram berikut). Bahkan jika ia dapat menempel pada bagian atas untai induk #2 pada posisi 5', ia tidak dapat bergerak ke bawah untai induk dan mensintesis untai anak dalam arah 3' hingga 5'. Oleh karena itu, DNA polimerase menempel lebih jauh ke bawah pada untai induk #2 dan menghasilkan serangkaian bagian DNA dalam arah 5' hingga 3'. Bagian ini diberi nama "Fragmen Okazaki" setelah ilmuwan Jepang Reiji Okazaki yang menemukannya. Bagian-bagian tersebut secara kolektif membentuk untai anak yang disebut "untai tertinggal" ke atas untai induk #2. Hal ini dijelaskan dengan baik oleh R. Ohki, T. Tsurimoto dan F. Ishikawa ( Biologi Molekuler dan Seluler Vol. 21, 2001). Primer RNA pendek harus menempel di depan setiap bagian DNA untuk membentuk titik awal untuk DNA polimerase.

Di sini ada masalah di ujung 3' untai induk #2. Ketika primer RNA terakhir mencapai ujung ini, tidak ada lagi cetakan DNA untuk mendahului DNA polimerase. Primer terakhir menempel pada ujung 3', tetapi DNA polimerase tidak dapat menambahkan bagian terakhir dari untai tertinggal, meninggalkan celah di mana primer terpasang. Oleh karena itu, ujung 5' dari setiap untai tertinggal yang baru disintesis dipotong pendek. Sekitar 100 pasangan basa dicukur dengan setiap putaran replikasi, sehingga memperpendek telomer. Dalam diagram berikut, untai induk #2 memiliki celah di ujung 5' dari untai tertinggal yang baru terbentuk.

Gif animasi berikut menunjukkan replikasi DNA dalam enam divisi berturut-turut tanpa pemendekan apa pun, dibandingkan dengan masalah replikasi akhir pada untai tertinggal dan pemendekan DNA secara bertahap.

Telomer dapat dipulihkan oleh enzim telomerase. Enzim ini memperpanjang telomer dalam sel germinal (sel yang menghasilkan telur dan sperma), sehingga mengembalikan telomer ke panjang maksimumnya dalam zigot. Hal ini juga hadir dalam sel-sel lain yang harus terus membelah, termasuk sel induk sumsum tulang yang menghasilkan sejumlah besar generasi sel darah merah yang diperlukan untuk mempertahankan kehidupan, epitel kulit, dan sel-sel yang melapisi usus. Telomerase umumnya tidak aktif dalam sel somatik normal. Enzim ini menambahkan urutan DNA noncoding mengulangi TTAGGG pada vertebrata ke ujung 3' untai DNA di wilayah telomer kromosom eukariotik. Kehadiran telomerase aktif dalam sel kanker mungkin berguna dalam diagnosis dan pengobatan beberapa kanker dengan inhibitor telomerase.

Paragraf berikut berasal dari Science and Technology (9 November 2007): Hiu memiliki telomerase di semua selnya. Telomer mereka tidak memendek dan hiu tidak memiliki rentang hidup yang diprogram secara genetik seperti manusia. Faktanya, hiu terus berkembang sepanjang hidupnya. Batas rentang hidup mereka adalah kenyataan bahwa mereka harus terus bergerak untuk mengedarkan udara melalui insang mereka untuk mengambil oksigen. Hiu sangat stabil secara genetik, setelah berubah sangat sedikit dalam ratusan juta tahun. Selain itu, hiu jarang terkena kanker.

Telomer dan telomerase juga terjadi pada sel tumbuhan. Biologi telomer tanaman dirangkum oleh T.D. McKnight dan D.E. Shippen di Sel Tanaman Vol. 16: 794-803 (2004). Pada kebanyakan tumbuhan berbunga, telomer terdiri dari basa DNA berulang TTTAGGG. Seperti sel somatik hewan, ada sedikit atau tidak ada telomerase aktif dalam jaringan vegetatif, meskipun diaktifkan kembali selama pembungaan, mungkin untuk memastikan bahwa gamet dan embrio mewarisi telomer yang dikembalikan ke panjang maksimumnya. Seperti sel kanker pada hewan, telomerase berfungsi penuh dalam sel kultur jaringan tanaman, seperti yang diharapkan untuk sel dengan kapasitas tak terbatas untuk proliferasi. Ordo monokotil Asparagales yang mengandung sekitar 27.000 spesies (kira-kira 10 persen dari semua angiospermae) memiliki pengulangan 6 basa TTAGGG, urutan yang sama yang ditemukan pada telomer mamalia. Ordo ini mencakup banyak famili tumbuhan yang sudah dikenal, seperti anggrek, iris, amarilis, agave, bawang, dan asparagus. Karena tumbuhan dan mamalia berevolusi menjadi organisme multiseluler di sepanjang jalur yang benar-benar terpisah, ini tampaknya merupakan contoh lain dari evolusi paralel (homoplasti).

Telomer tidak mencegah pemendekan DNA, mereka hanya menunda proses erosi. Mekanisme pemendekan telomer biasanya membatasi sel pada jumlah pembelahan yang tetap. Akhirnya, ketika semua telomer hilang, sel tidak dapat lagi membelah, sehingga mengakhiri siklus sel. Kebanyakan kanker adalah hasil dari sel-sel "abadi" yang telah menghindari kematian sel terprogram karena erosi telomer. Kromosom sel ganas biasanya tidak kehilangan telomernya, sehingga terjadi pembelahan sel yang tidak terkendali. Penelitian pada hewan menunjukkan bahwa panjang telomer mungkin terkait dengan proses penuaan pada tingkat sel dan rentang hidup hewan. Bahkan ada penelitian yang menunjukkan bahwa olahraga teratur dan pengurangan stres dapat membantu meminimalkan erosi telomer. Faktanya, sebuah penelitian yang diterbitkan dalam jurnal Circulation edisi 3 Mei 2005 menemukan bahwa penambahan berat badan dan peningkatan resistensi insulin berkorelasi dengan pemendekan telomer yang lebih besar dari waktu ke waktu.

Menarik untuk berspekulasi tentang asal usul telomer. Jika ada versi DNA polimerase lain yang menempel pada ujung 5' untai induk #2 dan menambahkan nukleotida dalam arah 3' hingga 5', maka secara teoritis untai kontinu dapat disintesis ke ujung cetakan untai induk tanpa ujung tersebut. masalah replikasi. Versi teoretis ini belum pernah ditemukan dan oleh karena itu telomer sangat penting untuk mencegah pemendekan DNA dan erosi gen secara bertahap. Mengapa hanya ada satu bentuk DNA polimerase yang mensintesis untai anak dalam arah 5' ke 3'? Ini seperti menanyakan mengapa sistem kehidupan hanya memiliki asam amino bentuk-L (tangan kiri) dan gula bentuk-D (tangan kanan). Apakah evolusi telomer memecahkan masalah replikasi yang melekat pada DNA asli, atau apakah telomer ada dalam DNA asli sel eukariotik pertama?

Signifikansi Evolusi dari Replikasi & Telomer Masalah Akhir

Ketika saya pertama kali menulis bagian ini tentang masalah replikasi akhir, saya menyimpulkan bahwa itu adalah cacat pada DNA yang secara harfiah memperpendek umur sel dengan membatasi jumlah pembelahan. Telomer berfungsi sebagai jam waktu mitosis yang memperpanjang hidup dengan sejumlah erosi berturut-turut. Namun, ada sisi lain dari cerita ini di mana membatasi rentang hidup organisme sebenarnya bisa bermanfaat. Dalam lingkungan yang berubah dengan cepat, kelangsungan hidup suatu spesies tergantung pada variabilitas genetik melalui mutasi DNA dan kemampuan untuk mewariskan gen-gen ini ke generasi mendatang. Suatu spesies dengan waktu generasi yang sangat panjang mungkin tidak dapat bersaing karena mutasi adaptif tidak dapat mengikuti perubahan lingkungan. Namun, rentang generasi yang lebih panjang juga dapat memperlambat pertumbuhan populasi selama fekunditas (jumlah keturunan per betina) tetap konstan. Bagi seorang individu, keabadian mungkin tampak baik, tetapi ini mungkin tidak baik untuk spesies. Logika ini disebutkan dalam Star Trek 2: "The Wrath of Khan" ketika Spock berkata: "Kebaikan banyak orang melebihi kebaikan segelintir orang, atau satu." Sebenarnya, logika ini disebutkan dua ribu tahun sebelumnya dalam Yohanes 11:49-50. Tentu saja, satu peringatan untuk keuntungan dari hilangnya replikasi akhir adalah hiu, yang tampaknya memiliki telomerase aktif di semua selnya dan panjang telomer yang tidak menurun secara signifikan seiring bertambahnya usia. Hiu (kelas Chondrichthyes) adalah kelompok yang sangat sukses dan mereka telah ada selama lebih dari 200 juta tahun. Bahkan, beberapa spesies memiliki perkiraan usia 100 tahun atau lebih. Tidak diragukan lagi, perubahan lingkungan di lautan tidak merajalela seperti di darat.

10. Untaian DNA Tunggal Mereplikasi Menjadi Helai Ganda

Campuran DNA dipanaskan sampai 72 o C (162 o F) dan DNA polimerase mengenali primer yang menempel pada setiap untai dan melanjutkan untuk mensintesis untai komplementer sampai ke gen. Nukleotida menempel di sepanjang gen dari semua adenin, timin, sitosin, dan guanin yang sudah ada dalam campuran. Sekarang campuran tersebut mengandung dua salinan gen yang identik (dua tangga DNA lengkap). DNA polimerase dari bakteri Thermus aquaticus (disebut TAQ polimerase) digunakan untuk reaksi karena kebal terhadap suhu tinggi. Tidak seperti kebanyakan enzim protein yang dihancurkan pada suhu di atas 40 o C (104 o F), DNA polimerase dari Thermus aquaticus dapat bertahan pada 72 o C reaksi. Padahal, bakteri ini biasanya hidup di sumber air panas dan dapat bertahan hidup pada suhu yang mendekati titik didih air.

Bakteri Sumber Air Panas Mendidih Di Taman Nasional Yellowstone

Mata air panas yang meminyaki di Taman Nasional Yellowstone diwarnai oleh koloni cyanobacteria termofilik, eubacteria, dan archaebacteria. Cyanobacteria berwarna oranye umumnya terdapat di air yang telah mendingin di bawah 73 o C (163 o F). Klorofil hijau pada bakteri fotosintetik ini ditutupi oleh pigmen karotenoid oranye. Seperti halobacteria merah terang dari danau garam, karotenoid melindungi sel-sel halus dari radiasi matahari yang intens, terutama selama bulan-bulan musim panas. Area kolam yang lebih hangat dan keputihan mengandung massa eubakteri nonfotosintetik yang berserabut. Thermus aquaticus bertahan pada suhu yang terlalu tinggi untuk bakteri fotosintetik, hingga 80 o C (176 o F). Thermus aquaticus adalah heterotrofik dan bertahan pada sejumlah kecil bahan organik di dalam air. TAQ polimerase yang digunakan dalam amplifikasi DNA menggunakan polymerase chain reaction (PCR) awalnya diisolasi dari koloni T. aquaticus yang dikumpulkan di sumber air panas di Taman Nasional Yellowstone.

Mata air panas mendidih di Taman Nasional Yellowstone. Warna oranye-merah disebabkan oleh koloni padat cyanobacteria fotosintesis.

Sebuah rchaebacteria berkembang dalam air mendidih di Taman Nasional Yellowstone, pada suhu 92 o C (198 o F). Bakteri ini juga tumbuh subur di dekat lubang uap di dasar laut pada suhu melebihi 115 o C (239 o F). Para ilmuwan dari seluruh dunia sedang mempelajari flora bakteri yang menakjubkan di Taman Nasional Yellowstone. Ini adalah salah satu tempat terbaik di bumi untuk mempelajari organisme ini di habitat alami mereka yang dilindungi. Di bagian lain dunia, sumber air panas serupa telah dihancurkan untuk produksi energi panas bumi.

Mata air panas mendidih di Taman Nasional Yellowstone. Warna oranye-merah disebabkan oleh koloni cyanobacteria fotosintesis yang berkembang. Massa berserabut eubakteri nonfotosintetik terjadi di daerah keputihan dari air hangat.

Mata air panas asam di Taman Nasional Yellowstone dengan pH di bawah 4,0 mendukung alga eukariotik Cyanidium caldarum . Alga fotosintesis yang luar biasa ini bahkan dapat bertahan hidup pada pH nol! Beberapa bakteri sumber air panas asidofilik memanfaatkan oksidasi belerang dan besi untuk sintesis ATP. Mata air panas alkali mendukung koloni bakteri yang memanfaatkan hidrogen sulfida untuk sumber energinya.

Kehidupan seperti yang kita ketahui mungkin pertama kali muncul lebih dari tiga miliar tahun yang lalu di lingkungan air mendidih bersuhu tinggi. Bakteri termofilik di mata air panas Taman Nasional Yellowstone mungkin merupakan populasi peninggalan kehidupan pertama di bumi. Faktanya, bakteri termofilik ini mungkin nenek moyang semua bentuk kehidupan lain, termasuk manusia!

11. Dua Tangga DNA "Unzip" Menjadi Empat Untaian Terpisah

Sekarang campuran itu sekali lagi dipanaskan sampai 95 o C dan molekul DNA untai ganda yang mengandung gen target terpisah menjadi untaian tunggal. Tapi sekarang ada empat untai tunggal dari dua gen beruntai ganda. Campuran sekali lagi didinginkan hingga 52-54 o C dan primer menempel pada untaian pada posisi awal sebelum setiap gen. DNA polimerase sekali lagi mengkatalisis pembangunan kembali setiap untai tunggal menjadi empat gen untai ganda lengkap. PCR disebut reaksi berantai polimerase karena reaksi terjadi berulang kali dalam siklus karena duplikat salinan gen diproduksi secara eksponensial. Setelah hanya 40 siklus akan ada 1.0995116 X 10 12 atau lebih dari satu triliun salinan gen asli!

Dua molekul DNA untai ganda (tangga DNA) terpisah menjadi empat untai. DNA polimerase akan membangun kembali untai komplementer untuk setiap tangga, menghasilkan empat molekul DNA untai ganda. Catatan: Ilustrasi ini tidak menunjukkan masalah replikasi akhir di mana DNA memendek selama pembelahan berulang.

12. Menggunakan DNA Kutu Sampai Saat Ini Pakaian Pertama Yang Dipakai Orang

Salah satu kegunaan paling baru untuk pengurutan DNA adalah penentuan kapan manusia pertama kali mulai mengenakan pakaian. Menurut Mark Stoneking dan rekan-rekannya di Max Planck Institiute for Evolutionary Anthropology di Leipzig, Jerman, kami mulai mengenakan pakaian sekitar 70.000 tahun yang lalu. Tanggal ini didasarkan pada gen kutu penghisap manusia. Ini berkorelasi dengan perkiraan waktu ketika kutu tubuh berevolusi dari kutu kepala manusia dan sesuai dengan waktu ketika habitat kutu tubuh (pakaian) menyebar luas. Ini juga merupakan saat ketika Homo sapiens sapiens mulai bergerak keluar dari Afrika ke wilayah Eropa yang lebih dingin.


Kutu kepala manusia
Kutu penghisap termasuk dalam ordo serangga parasit Anoplura yang tidak bersayap. Kutu penghisap manusia meliputi kutu badan, kutu kepiting dan kutu kepala (Pediculus humanus). Anoplurans menggunakan satu set stilet panjang seperti hipodermik untuk menembus kulit dan menarik darah. Setelah menelan darah, tubuh mereka menjadi bengkak dan menunjukkan gumpalan darah berwarna gelap di perut mereka. Ada dua bentuk kutu penghisap manusia, kutu kepala ( P. humanus capitis ) dan kutu badan ( P. humanus humanus ). Kutu kepala menyerang rambut di kulit kepala dan kutu badan hidup di pakaian dekat permukaan tubuh. Kutu manusia juga dikenal sebagai "cooties" dan telurnya yang menempel pada rambut disebut "nits." Kutu manusia menyebabkan gatal-gatal lokal, tetapi ketidaknyamanannya kecil dibandingkan dengan kesengsaraan bakteri yang dapat mereka tularkan yang disebut Rickettsia prowazeki . Bakteri kecil ini menyebabkan "Tifus Epidemi," penyakit serius yang telah menghancurkan populasi di Eropa abad pertengahan.

S toneking dan rekan-rekannya Ralf Kittler dan Manfred Kayser membandingkan urutan DNA mitokondria dari kutu kepala dan tubuh. Semakin besar perbedaan urutan antara dua bentuk kutu, semakin tua pemisahan evolusioner mereka. Kutu manusia dari Afrika lebih beragam secara genetik daripada kutu dari bagian lain dunia, menunjukkan bahwa spesies tersebut berasal dari Afrika. Kutu kepala lebih beragam daripada kutu tubuh, menunjukkan bahwa mereka adalah kelompok yang lebih tua. Dengan membandingkan DNA mitokondria kutu tubuh dengan kutu simpanse, tim Stoneking mampu memperkirakan asal kutu tubuh sekitar 70.000 tahun yang lalu. Tanggal ini berkorelasi baik dengan bukti yang berkembang bahwa manusia modern berevolusi di Afrika dan bermigrasi ke utara sekitar 100.000 tahun yang lalu.

S toneking juga mempelajari kutu kepiting manusia ( Pthirus pubus ) yang biasanya menghuni rambut kemaluan. Kutu kemaluan manusia lebih dekat hubungannya dengan kutu gorila daripada kutu kepala. Karena kutu penghisap ini hanya menghuni tempat berbulu di tubuh, mungkin kutu ini bisa menjelaskan ketika manusia kehilangan rambut tubuh yang berat. Kutu kepiting biasanya ditularkan dari orang ke orang melalui hubungan seksual, meskipun mereka juga dapat diambil dari linen, pakaian, dan sumber lain yang terinfeksi.


PENGANTAR

Molekul aromatik polisiklik diketahui berinterkalasi menjadi DNA untai ganda (1, 2). Terlepas dari perlakuan teoretis dari interaksi tuan rumah-tamu tersebut, konsekuensi interkalasi DNA oleh molekul eksogen telah menarik minat yang cukup besar dalam kimia obat, karena pembentukan kompleks seperti itu mengarah pada modifikasi signifikan dari struktur DNA dan dapat mengakibatkan hambatan atau penekanan. fungsi asam nukleat dalam proses fisiologis (3-10). Karena pengaruh tersebut pada sistem biologis merupakan persyaratan utama untuk obat penargetan DNA, interkalasi molekul kecil menjadi DNA dapat diterapkan dalam pendekatan terapeutik di mana penekanan replikasi DNA dan transkripsi gen digunakan untuk menghancurkan sel tumor atau jaringan yang terinfeksi. . Akibatnya, banyak penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan lebih banyak wawasan dalam berbagai aspek proses asosiasi molekul besar dan kecil dengan DNA untuk mendapatkan interkalator yang sangat selektif dan efisien (11).

Pewarna organik kationik biasanya dianggap sebagai interkalator klasik. Contoh representatif adalah turunan acridine seperti proflavin (1) atau acridine orange (12), pewarna azin seperti metilen biru (13), garam fenanthridinium seperti etidium bromida (14) atau pewarna sianin seperti tiazol oranye (agregatnya juga dapat ikat ke alur kecil) ( 15-17 ). Asosiasi senyawa ini dengan DNA biasanya mempengaruhi sifat penyerapan dan emisinya, sehingga interaksinya dengan DNA dapat dievaluasi secara kualitatif dan kuantitatif dengan titrasi spektrofotometri dan spektrofluorometri (18). Metode spektroskopi sederhana dan langsung ini sangat menguntungkan karena pewarna organik menyerap dan memancarkan pada panjang gelombang yang tidak mengganggu penyerapan basa DNA.maksimal= 260nm). Dengan demikian, titrasi spektrofotometri dan spektrofluorometri biasanya menunjukkan asosiasi pewarna dengan DNA. Selain itu, isoterm pengikatan yang dihasilkan dapat digunakan untuk memperkirakan konstanta pengikatan dan ukuran situs pengikatan, yaitu jumlah situs pengikatan yang ditempati. Selain itu, penyerapan cahaya terpolarisasi sirkular atau linier dapat digunakan dalam spektroskopi dikroisme sirkular (CD) dan dikroisme linier (LD) untuk mendapatkan pengetahuan lebih lanjut tentang orientasi molekul pewarna relatif terhadap DNA dan untuk menyimpulkan mode pengikatan. .Pengukuran polarisasi fluoresensi keadaan tunak serta transfer energi fluoresensi dari basa DNA ke pewarna terikat telah digunakan sebagai kriteria tambahan yang dapat diandalkan untuk menjelaskan mode pengikatan (20). Selain metode spektroskopi, kriteria hidrodinamik dan termodinamika seperti viskositas, koefisien sedimentasi, atau suhu leleh DNA dapat digunakan untuk mengevaluasi mode pengikatan (20).

Umumnya ditetapkan bahwa muatan positif meningkatkan kecenderungan molekul untuk mengikat DNA karena interaksi ionik yang menarik antara kation dan tulang punggung fosfat (21). Pada sebagian besar pewarna kationik, muatan positif ini dibentuk oleh fungsi amonium eksosiklik atau oleh bagian piridinium endosiklik. Fungsionalitas ini biasanya dikuatkan oleh alkilasi atau protonasi. Dalam kasus terakhir, bagaimanapun, ini mengarah pada pengaruh yang signifikan dari pH pada sifat pengikatan DNA. Sebaliknya, pewarna kationik dengan kuartener endosiklik pangkalan atom nitrogen agak jarang dan beberapa studi sistematis ada untuk kelas senyawa ini. Dalam artikel ini kami akan merangkum studi tentang sifat pengikatan DNA turunan quinolizinium (Skema 1) (22) sebagai contoh representatif untuk pewarna dengan atom nitrogen jembatan kuaterner, dan kami akan menunjukkan bahwa turunan quinolizinium annelated dapat berfungsi sebagai platform yang berguna untuk desain pewarna interkalasi.


BAHAN DAN METODE

Bahan

Nuklease P1 (dari Penicillium citrinum ) dibeli dari Calbiochem, EMB Biosciences, Inc. (San Diego, CA). Timus betis (ct)-DNA, fosfodiesterase bisa ular dan fosfodiesterase limpa anak sapi diperoleh dari Sigma Chemical Co. (St Louis, MO). Alkaline phosphatase dibeli dari Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN). 2′-Deoxyadenosine-5′-triphosphate-1,3,7,9- 15 N 4 -(4-amino- 15 N) (dATP- 15 N 5 ) dan 2′-deoxyguanosine-5′-triphosphate-1,3,7,9- 15 N 4 -(2-amino- 15 N) (dGTP- 15 N 5 ) berasal dari Medical Isotop, Inc. (Pelham, NH). (5′ S )-cdA diperoleh dari Berry & Associates, Inc. (Ann Arbor, MI). Asetonitril (kelas HPLC) berasal dari Burdick dan Jackson (Muskegon, MI). Membran filtrasi ultra Biomax5 (pemotongan massa molekul 5 kDa) dibeli dari Millipore (Bedford, MA). Air (kelas HPLC) untuk analisis LC/MS berasal dari J.T. Baker (Philipsburg, NJ). Air yang dimurnikan melalui sistem Milli-Q (Millipore) digunakan untuk semua aplikasi lainnya. 2′-Deoxyadenylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-deoxyadenosine 3′-monophosphate [d(AcA)-3′-p], 2′-deoxycytidylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-deoxyadenosine 3′-monophosphate [d(CcA)-3′-p], 2′-deoxyguanylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-deoxyadenosine 3′-monophosphate [d(GcA)-3′-p] dan 2′-deoxythymidylyl(3′→5′)-(5′ S )-8,5′-cyclo-2′-deoxyadenosine 3′-monophosphate [d(TcA)-3′-p], dan oligodeoxynucleotides yang mengandung (5′ S )-cdA dan tanpa gugus fosfat akhir disintesis seperti yang dijelaskan di tempat lain (10, 20).

Iradiasi DNA

Sebuah larutan buffer berair DNA (10 mM dapar fosfat, pH 7,4, 0,3 mg/ml) dijenuhkan dengan N 2 O dan disinari dengan sinar gamma dalam sumber gamma 60 Co dengan dosis 2 Gy (laju dosis 24 Gy/menit). Selanjutnya, larutan DNA yang diiradiasi dan tidak diradiasi didialisis terhadap air selama 18 jam. Air di luar tabung dialisis diganti tiga kali selama dialisis. Aliquot 50 g DNA dikeringkan dalam SpeedVac di bawah vakum.

Isolasi DNA dari hati babi

Hati babi beku diperoleh dari Pel-Freeze, Inc. (Rogers, AK). Dua metode isolasi DNA digunakan. Metode pertama (metode fenol-kloroform) pada dasarnya seperti yang dijelaskan sebelumnya (21). Secara singkat, jaringan dihomogenisasi dalam 10 vol buffer homogenisasi (1% SDS + 1 mM EDTA), kemudian 500 g/ml Proteinase K ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Homogenat kemudian diekstraksi dengan fenol, fenol-Sevag (kloroform/isoamil alkohol dengan perbandingan 24:1), dan kemudian dengan Sevag. DNA diendapkan dengan 1 vol. etanol dingin dan dilarutkan dalam 0,01 × SSC (1,5 mM NaCl, 0,15 mM natrium sitrat, pH 8,0). DNA diperlakukan dengan RNase T1 (50 U/ml) dan RNases A (50 g/ml) selama 30 menit pada 37°C, kemudian diekstraksi dengan volume Sevag yang sama. DNA diendapkan dari lapisan air menggunakan etanol dingin dan dicuci dengan etanol 70%. DNA kemudian dilarutkan dalam 0,01x SSC pada 1 mg/ml. Kami juga menguji efek penambahan desferoximine 1,25 mM (Sigma) ke buffer homogenisasi sebelum homogenisasi.

Metode kedua adalah metode ekstraksi garam tinggi seperti yang dijelaskan sebelumnya (22, 23). Jaringan beku (1 g) dihomogenisasi dalam 8 ml larutan Lysis (0,5 M Tris, pH 8,0, 20 mM EDTA, pH 8,0, 10 mM NaCl, 1% SDS). Proteinase K (0,5 mg/ml) ditambahkan ke dalam campuran diikuti dengan inkubasi semalaman pada suhu 37°C. Keesokan harinya, 4 ml larutan NaCl jenuh ditambahkan ke dalam campuran, yang dicampur vortex selama 1 menit, dan kemudian diinkubasi pada 56 ° C selama 15 menit. Campuran disentrifugasi selama 30 menit dengan 16 000 G dan supernatan dikumpulkan. Setelah sentrifugasi lain, DNA dalam supernatan diendapkan menggunakan 1 vol. etanol dingin, dicuci dengan etanol 70% dan dilarutkan dalam 0,01 × SSC. DNA kemudian diperlakukan dengan RNase, diekstraksi dengan Sevag, diendapkan dan dilarutkan seperti dijelaskan di atas.

Hidrolisis enzim dinukleotida, oligodeoksinukleotida dan DNA

Untuk hidrolisis enzim, 2 pmol (5′ S )-cdA- 15 N 5 sebagai standar internal ditambahkan ke 100 pmol dinukleotida dan oligodeoksinukleotida. Jumlahnya (5′ S )-cdA- 15 N 5 ditambahkan ke 50 g sampel ct-DNA yang tidak diradiasi dan yang diiradiasi masing-masing adalah 0,2 dan 1 pmol. Setelah penambahan standar internal, sampel dinukleotida, oligodeoksinukleotida dan DNA dikeringkan dalam SpeedVac di bawah vakum, dan kemudian dilarutkan dalam 50 l larutan 10 mM Tris–HCl (pH 7,5) ditambah dengan 2,5 l natrium asetat 1 M yang mengandung 45 mM ZnCl 2 (pH akhir 6.0). Aliquot nuklease P1 (5 U), racun ular phosphodiesterase (0,004 U) dan alkaline phosphatase (32 U) ditambahkan dan sampel diinkubasi pada 37°C selama 6, 24 atau 48 jam. Dalam beberapa kasus, fosfodiesterase limpa (0,004 U) juga digunakan. Gugus 3′-fosfat dinukleotida dihilangkan dengan hidrolisis dengan alkali fosfatase selama 6 jam dengan cara yang sama untuk mendapatkan dinukleosida monofosfat d(AcA), d(CcA), d(GcA) dan d(TcA). Setelah hidrolisis, sampel disaring menggunakan membran ultrafiltrasi dengan cutoff massa molekul 5 kDa dengan sentrifugasi pada 6000 G selama 30 menit.

Untuk menentukan apakah kondisi hidrolisis enzim yang digunakan dalam 32 studi pascapelabelan P yang dilaporkan sebelumnya (20) juga akan melepaskan (5′ S )-cdA, 100 pmol dinukleotida atau oligodeoksidinukleotida diinkubasi dalam 10 l larutan yang mengandung 30 mM natrium suksinat (pH 6), 10 mM CaCl 2 , 500 mU micrococcal nuclease dan 10 mU limpa fosfodiesterase (Worthington Biochemicals, Vineland, NJ). Pencernaan dilanjutkan selama 3,5 jam pada suhu 37°C. Kemudian, 4 l larutan yang mengandung 225 mM natrium asetat (pH 5,0), 0,55 mM ZnCl 2 dan 5,6 g nuklease P1 ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan selama 45 menit pada 37°C. Reaksi dinetralkan dengan menambahkan 2,6 l buffer CHES [2-(cyclohoxylamino)ethanesulfonic acid] 0,75 M (pH 9,7), dan sampel dibekukan di atas es kering. Sampel kemudian dicairkan dan diperlakukan dengan alkaline phosphatase seperti dijelaskan di atas.

Analisis oleh LC/MS

Analisis dengan LC/MS dengan proses API-ES menggunakan teknik pengenceran isotop dan pemantauan ion terpilih (SIM) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (17). Kolom fase-terbalik Zorbax Eclipse XDB C18 (15 cm × 2,1 mm id, ukuran partikel 5 m) (Agilent Technologies, Rockville, MD) digunakan. Kolom pelindung yang dikemas dengan fase diam yang sama (1 cm × 2,1 mm i.d.) dipasang ke kepala kolom. Pelarut A adalah campuran air dan asetonitril (98:2, v/v) dan pelarut B adalah 100% asetonitril. Gradien 0,5% dari pelarut B per menit digunakan. Laju aliran adalah 0,2 ml/menit. Temperatur kolom dijaga pada 30°C. Standar internal berlabel isotop (5′ S )-8,5′-cyclo-2′-deoxyadenosine-1,3,7,9- 15 N 4 -(4-amino- 15 N) [(5′S)-cdA- 15 N 5 ] disiapkan menggunakan dATP-15 N 5 seperti yang dijelaskan sebelumnya (18). Aliquot (20 l) hidrolisat enzim yang disaring disuntikkan ke kolom LC tanpa perawatan lebih lanjut. Bila perlu, efluen dilewatkan melalui spektrofotometer UV untuk memantau absorbansi (5′ S )-cdA dan dinukleosida monofosfat, sebelum dimasukkan ke dalam ruang ion spektrometer massa. Identifikasi dan kuantifikasi 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OH-dG) dan 8-hydroxy-2′-deoxyadenosine (8-OH-dA) dilakukan seperti yang dijelaskan di tempat lain (24, 25). Standar internal berlabel isotop 8-OH-dG-15 N 5 dan 8-OH-dA- 15 N 5 diisolasi dari larutan iradiasi gamma dGTP-15 N 5 dan dATP-15 N 5 , masing-masing, menggunakan LC semi-preparatif dan prosedur yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk isolasi (5′ S )-cdG- 15 N 5 dan (5′ S )-cdA- 15 N 5 ( 18 ).


Afiliasi

Laboratorium Kunci Negara Pengendalian Polusi dan Penggunaan Kembali Sumber Daya, Sekolah Tinggi Ilmu dan Teknik Lingkungan, Universitas Tongji, Shanghai, 200092, PR, Cina

Xian Zhang, Ling Chen & Hong-Wen Gao

Laboratorium Utama Lingkungan Air Sungai Yangtze Kementerian Pendidikan, Sekolah Tinggi Ilmu dan Teknik Lingkungan Universitas Tongji, Shanghai, Humas, Cina, 200092

Sekolah Tinggi Teknik Lingkungan, Universitas Kehutanan NanJing, Nanjing, 210037, PR, Cina


Tonton videonya: BAHAS SOAL KIMIA 12: Campuran yang Bereaksi menghasilkan Ester (Juni 2022).


Komentar:

  1. Phillip

    good information

  2. Domuro

    luar biasa, bagian yang bermanfaat

  3. Sabah

    The site is good, but I feel like something is missing.

  4. JoJoran

    Said in confidence, my opinion is then evident. I recommend finding the answer to your question on google.com

  5. Ewyn

    You just visited brilliant idea

  6. Mogis

    I find that you are not right. Saya yakin. Saya bisa membuktikan nya. Write in PM.



Menulis pesan