Informasi

Pewarnaan antibodi

Pewarnaan antibodi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya mewarnai bagian jaringan dan saya melakukan kesalahan, saya seharusnya mencampur 3 antibodi primer tetapi saya hanya menodai salah satunya. Setelah inkubasi 1 jam saya mencuci 10 menit dengan PBS dan kemudian saya melakukan inkubasi satu jam lagi dengan 2 antibodi yang saya lupa tambahkan sebelumnya. Bisakah itu memengaruhi pewarnaan saya? Saya khawatir saya ingin menguji pengenceran berbeda dari antibodi pertama yang saya tambahkan sendiri, dan kemudian saya menambahkan inkubasi satu jam lagi dengan 2 antibodi lagi.


Apakah ini ELISA? Dalam hal ini, saya sarankan Anda melakukan percobaan ini lagi karena sekarang Anda sedang inkubasi selama satu jam ekstra. Waktu inkubasi diatur pada kisaran tetap karena meningkatkannya juga dapat meningkatkan kebisingan latar belakang pengujian Anda.

Waktu inkubasi - sensitivitas dapat ditingkatkan dengan waktu inkubasi yang lebih lama pada suhu kamar. Ketahuilah bahwa bagian atas kurva mungkin mendatar dan menjadi tidak dapat digunakan, sehingga membatasi rentang pengujian. Selain itu, latar belakang dapat meningkat

Sumber daya: https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf


Umumnya untuk pewarnaan IHC/ICC secara terpisah dengan antibodi tidak menjadi masalah. Pewarnaan dengan langkah-langkah antibodi primer yang terpisah sering dilakukan ketika antibodi berasal dari spesies yang tidak kompatibel dan mungkin bereaksi silang satu sama lain memberikan pewarnaan non-spesifik.

Namun, pencucian 10 menit dan inkubasi 1 jam dengan antibodi lain dapat menghilangkan beberapa antibodi pertama, membuat Anda memiliki sinyal yang lebih lemah dari yang diharapkan. Ini dapat memengaruhi seberapa "cerah" noda Anda muncul setelah langkah antibodi sekunder.


Jelajahi tabel di bawah untuk kemungkinan penyebab tidak ada pewarnaan, dan cara memperbaikinya — atau mencegahnya sama sekali.

Kemungkinan penyebab

Solusi

Antibodi primer dan antibodi sekunder tidak kompatibel

  • Pastikan Anda menggunakan antibodi sekunder yang dibangkitkan terhadap spesies antibodi primer.
  • Pastikan bahwa isotipe primer dan sekunder kompatibel.
  • Tambahkan konsentrasi antibodi primer yang lebih tinggi
  • Inkubasi sampel lebih lama dengan antibodi (misalnya semalaman) pada suhu 4°C.
  • Periksa lembar data antibodi untuk melihat apakah antibodi telah divalidasi pada jenis IHC yang Anda gunakan (misalnya fiksasi formalin/PFA, beku segar, dll).
  • Uji antibodi dalam western blot asli (tidak didenaturasi) untuk memastikannya tidak rusak.
  • Periksa petunjuk penyimpanan untuk produk Anda di lembar data.
  • Hindari pembekuan/pencairan yang berlebihan.
  • Jalankan kontrol positif.
  • Jalankan kontrol positif.
  • Periksa literatur ilmiah untuk melihat apakah protein diharapkan dalam jenis jaringan.
  • Gunakan penguatan sinyal untuk memaksimalkan sinyal, misalnya antibodi sekunder terkonjugasi biotin.
  • Selalu simpan antibodi sekunder terkonjugasi fluorofor dalam gelap. Paparan terlalu banyak cahaya dapat menyebabkan photobleaching.
  • Deparafinisasi bagian lebih lama dan gunakan xilena segar.
  • Gunakan metode pengambilan antigen yang berbeda untuk membuka kedok epitop (misalnya panas yang dimediasi dengan buffer pH 6 atau pH 9, enzimatik, dll).
  • Perbaiki bagian untuk waktu yang lebih singkat.
  • Tambahkan zat permeabilisasi yang kuat seperti Triton X ke buffer pemblokiran dan buffer pengenceran antibodi. Lihat protokol kami tentang teknik permeabilisasi.
  • Gunakan deterjen yang tidak terlalu keras (misalnya Tween 20, bukan Triton X). Atau cukup hapus agen permeabilisasi dari buffer Anda. Lihat protokol kami tentang teknik permeabilisasi.
  • Tambahkan 0,01% azida ke buffer penyimpanan antibodi.
  • Gunakan buffer segar dan steril (misalnya PBS steril kami).

Panel Penanda Organel

Bekerja sama dengan proyek Human Protein Atlas, kami telah mengembangkan kumpulan penanda referensi yang menargetkan berbagai lokasi subseluler di dalam sel. Fokus dari awal adalah untuk memilih target dan mengembangkan antibodi menjadi penanda ideal untuk organel yang berbeda.

Panel tersebut menyertakan penanda untuk 15 lokasi subselular yang berbeda, yang dibuat oleh 27 antibodi. Beberapa antibodi yang menargetkan organel yang sama dengan isotipe atau epitop yang berbeda memungkinkan Anda memilih antibodi yang paling sesuai dengan eksperimen Anda, dan memfasilitasi multiplexing.

Jelajahi Penanda Organel

Panel Organelle Marker lengkap disajikan dalam katalog produk kami. Pilih di antara beberapa antibodi yang berbeda untuk setiap organel.


Pewarnaan antibodi dari embrio Parhyale hawaiensis

Keragaman besar tubuh arthropoda, bersama dengan pemahaman terperinci kami tentang perkembangan lalat buah, menjadikan arthropoda sebagai takson utama untuk memeriksa diversifikasi evolusi pola perkembangan dan karenanya keragaman kehidupan yang masih ada. Crustacea, khususnya, menunjukkan kisaran morfologi yang luar biasa dan memberikan kelompok luar yang berguna bagi serangga. Amphipoda krustasea Parhyale hawaiensis menjadi organisme model untuk studi perkembangan dalam arthropoda. Protokol ini menyediakan protokol yang disederhanakan untuk pewarnaan antibodi embrio P. hawaiensis. Metode ini juga bekerja dengan baik untuk artropoda dan filum lainnya. Embrio tetap direhidrasi, dicuci, diblokir dengan serum kambing normal, dan diinkubasi semalaman dengan antibodi primer. Embrio kemudian dicuci dan diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase yang berikatan dengan antibodi primer. Reaksi histokimia berikutnya menghasilkan noda hitam di sel-sel di mana antibodi telah terlokalisasi.


Hasil

Desain Pipeline Terintegrasi untuk Akuisisi dan Analisis Eksperimen Pemantauan Kekebalan Besar

Melakukan percobaan pemantauan kekebalan skala besar dalam jangka waktu yang lama menggunakan sitometri massa menimbulkan beberapa tantangan. Pertama, sangat penting untuk memantau kinerja instrumen dan mengevaluasi kualitas data sampel untuk mengidentifikasi fluktuasi sementara dalam kinerja instrumen yang menghasilkan fitur seperti berkurangnya pewarnaan untuk satu atau lebih penanda, lebih tinggi dari jumlah serpihan atau doublet biasa. Dua, efek batch karena variasi eksperimental atau instrumen dapat menjadi perhatian yang signifikan. Sementara peneliti harus selalu menyadari bagaimana sumber teknis dapat menyebabkan variasi, hal ini terutama berkaitan ketika data dikumpulkan dan diperoleh selama berminggu-minggu atau berbulan-bulan. Oleh karena itu, desain eksperimen harus mencakup mekanisme yang mendeteksi kedua jenis kegagalan dan mengingatkan peneliti dengan tepat. Akhirnya, peran operator manusia harus diminimalkan untuk mengurangi variabilitas yang disebabkan oleh manusia. Pengambilan keputusan harus mengikuti protokol yang jelas atau dipercayakan pada metode komputasi.

Kumpulan data ekspresi antibodi yang dijelaskan dalam penelitian ini mengintegrasikan beberapa teknik untuk memaksimalkan reproduktifitas eksperimental dan teknis serta merampingkan akuisisi dan analisis data (Gambar 1). Sampel sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari tiga donor sehat (Gambar 1A) diwarnai dengan panel antibodi 21 penanda yang terdiri dari penanda untuk secara jelas mengidentifikasi semua kompartemen imun utama: Sel B, sel myeloid, Sel NK, dan Sel T, bersama dengan perincian lebih lanjut untuk subset dalam kompartemen ini (seperti monosit CD16 +/– atau Sel B naif vs. transisi). Panel antibodi inti ini diliofilisasi sebagai koktail tunggal dan batch yang sama digunakan di seluruh akuisisi sampel untuk meminimalkan variabilitas eksperimental karena variabilitas reagen atau pemipetan. Panel hanya menggunakan subset saluran yang tersedia dalam sitometri massal, yang memungkinkan peneliti untuk memasukkan 10&0201315 penanda tambahan untuk menjawab pertanyaan khusus eksperimen.

Setelah pewarnaan panel antibodi inti awal, sampel dibagi menjadi dua kelompok untuk mengevaluasi dampak fiksasi pada masing-masing epitop antibodi yang kemudian dievaluasi di layar ini. Desain ini juga mencirikan desain eksperimental umum di mana perlakuan (fiksasi) dibandingkan dengan kontrol (sampel segar). Enam pasien x kombinasi pengobatan diberi kode batang dan dikumpulkan menggunakan strategi pengkodean bebas ganda yang kompatibel dengan sel hidup yang memanfaatkan antibodi CD45 yang terkonjugasi ke 4 isotop berbeda. Pendekatan barcode ini merampingkan pemrosesan sampel dan meminimalkan potensi variabilitas karena memperoleh pasien atau perawatan yang berbeda pada waktu yang berbeda. Isotop yang digunakan untuk kode batang dipilih secara khusus untuk memastikan bahwa potensi tumpahan karena pengotor isotop atau pembentukan oksida dari saluran kode batang ini tidak akan memengaruhi saluran antibodi lain mana pun yang diukur dalam percobaan ini. Selanjutnya, sampel didistribusikan secara merata di masing-masing dari 372 sumur kit LEGENDScreen, yang masing-masing mencakup antibodi terkonjugasi PE terhadap epitop yang berbeda. Setelah ini dengan antibodi anti-PE terkonjugasi logam memungkinkan pengukuran satu set penanda permukaan yang komprehensif di semua subset sel yang diidentifikasi oleh panel lyophilized luas. Akhirnya, untuk merampingkan akuisisi data, set 10 sumur selanjutnya diberi kode batang dan digabungkan menggunakan strategi kombinatorial yang memanfaatkan lima saluran paladium.

38 sampel batch yang dihasilkan kemudian diperoleh menggunakan sitometer massa Helios (Gambar 1B). Akuisisi membutuhkan sekitar 400 jam waktu instrumen selama 5 minggu operasi dan menghasilkan total 63 juta peristiwa. Menganalisis sejumlah besar data secara manual akan memakan waktu dan mempertaruhkan variabilitas yang diperkenalkan oleh operator. Untuk menghindari dua masalah ini, kami menggunakan Platform Sitometri Astrolabe standar untuk melakukan debarcode dan membersihkan data, memberi label subset sel, dan melakukan pengelompokan tanpa pengawasan (Gambar 3C). Analisis Astrolabe membutuhkan waktu 24 jam, dan ekspor 𠇊nalisis” platform digunakan dalam semua analisis lanjutan.

Data Sampel yang Di-debarcode Kuat dan Konsisten di Seluruh Sampel Layar

Kumpulan data pewarnaan antibodi melibatkan sejumlah besar sampel, desain eksperimen yang kompleks, periode akuisisi yang lama, dan analisis komputasi lanjutan, yang mana pun berpotensi menimbulkan variabilitas atau artefak lainnya. Beberapa tes memeriksa berbagai tahap percobaan (Gambar 2). Pertama dan terpenting, debarcoding yang akurat sangat penting untuk semua analisis tindak lanjut. Langkah ini sangat menantang karena skema kode batang dua tingkat yang digunakan: kode batang berbasis CD45 untuk pengobatan pasien x dan kode batang berbasis paladium dari setiap kumpulan 10 antibodi LEGENDScreen. Astrolabe dengan benar mengidentifikasi semua 60 kode dan profil salurannya berbeda dan mengikuti desain yang diharapkan (Gambar 2A). Untuk memvalidasi pendekatan debarcoding komputasi, hasilnya dibandingkan dengan data debarcode manual untuk salah satu batch. Kedua metode menunjukkan kesesuaian yang tinggi menurut empat metrik statistik yang berbeda (Gambar 2B), mendukung penggunaan pendekatan komputasi yang lebih efisien untuk debarcode semua 2.232 sampel.

Gambar 2. Frekuensi subset dan intensitas penanda konsisten di seluruh akuisisi eksperimen LEGENDScreen. (A) Debarcoding heat map untuk satu batch dari 38. Baris adalah acara yang di-debarcode, kolom adalah saluran barcoding. Intensitas ubin adalah median saluran dalam acara. Astrolabe mendebarcode dengan benar semua kode dalam kumpulan ini. (B) Plot batang membandingkan debarcoding Astrolabe dengan debarcoding manual menggunakan empat skor akurasi: Precision (0,996), Recall (0,914), Skor F1 (0,953), dan Koefisien Korelasi Matthews (MCC, 0,943). (C) Plot pencar dari Analisis Komponen Utama (PCA) di atas vektor frekuensi subset sel untuk semua sampel. Sumbu adalah komponen pertama dan kedua, titik adalah sampel yang diberi kode warna oleh donor. Ketiga donor berbeda satu sama lain dan secara internal seragam di seluruh akuisisi. (D) Untuk setiap pasangan, plot teratas adalah plot pencar frekuensi subset sel di semua sampel, diurutkan berdasarkan batch. Plot bawah adalah plot kotak intensitas penanda kanonik di semua batch. Dari atas ke bawah: Intensitas Sel T dan CD3, Intensitas Sel B dan CD19, Intensitas Sel NK dan CD56, dan Intensitas Monosit CD14+ dan CD14. Dalam semua kasus, baik frekuensi dan intensitas kuat selama periode akuisisi.

Titik awal untuk kumpulan data adalah darah dari tiga donor sehat. Setelah pengobatan tetap vs. baru dan pengenalan antibodi kit, masing-masing individu ini menghasilkan beberapa ratus sampel yang berbeda. Namun, profil kekebalan donor individu di setiap rangkaian sampel diharapkan identik dan oleh karena itu data yang diperoleh harus sangat sebanding. Ini tercermin dalam peta analisis komponen utama (PCA) di atas frekuensi subset sel sampel (Gambar 2C). Sampel tersebar di tiga pulau yang terpisah dengan baik. Setiap pulau sesuai dengan satu individu, menandakan bahwa profil kekebalan konsisten selama akuisisi.

Kami selanjutnya menerapkan Average Overlap Frequency (AOF) sebagai metrik untuk mengevaluasi kualitas pewarnaan penanda individu di semua kumpulan sampel (38). Langkah QC ini mengidentifikasi masalah dengan pewarnaan beberapa penanda dalam tiga kelompok (Gambar 1A Tambahan). Pemeriksaan lebih lanjut dari skor menyoroti beberapa penanda bermasalah (Gambar 1B Tambahan). Evaluasi data sel tunggal untuk salah satu penanda ini, CD27, mengungkapkan peningkatan pewarnaan latar belakang yang bergantung pada waktu yang menghasilkan pengurangan resolusi penanda dari waktu ke waktu, yang kami kaitkan dengan kerusakan instrumen Helios selama akuisisi (Gambar 1C Tambahan). Namun, membatasi analisis hanya pada peristiwa di kuartal pertama jendela akuisisi untuk batch ini menghasilkan nilai AOF dalam kisaran batch lain, memungkinkan pemulihan data skrining antibodi yang valid meskipun ada masalah teknis (Gambar 1D Tambahan). Identifikasi cepat, isolasi, dan solusi dari artefak teknis ini difasilitasi oleh pendekatan kontrol kualitas standar menggunakan metrik AOF yang terdefinisi dengan baik.

Kecuali untuk efek batch yang diidentifikasi oleh AOF QC, kumpulan data konsisten di seluruh himpunan bagian sel dan intensitas penanda (Gambar 2D). Untuk empat subset sel utama (dari atas ke bawah: Sel T, Sel B, Sel NK, dan Monosit CD14+), kami memeriksa frekuensi di setiap sampel (masing-masing panel atas, diurutkan berdasarkan batch). Frekuensi subset memiliki variasi yang sangat kecil di semua sampel donor yang diberikan. Selain itu, distribusi penanda kanonik dari setiap subset (masing-masing CD3, CD19, CD56, dan CD14) juga konsisten di seluruh sampel (panel bawah masing-masing, satu kotak untuk setiap batch).

Kombinasi langkah-langkah kontrol kualitas di atas menyoroti kekokohan keseluruhan dari kumpulan data pewarnaan antibodi. Data pewarnaan keseluruhan kohesif untuk setiap donor, dan untuk setiap subset sel di seluruh donor, dan masalah akuisisi spesifik diidentifikasi dan ditangani menggunakan metrik QC otomatis.

Platform Astrolabe Dengan Benar Memberi Label Subset Sel dan Memberikan Pengelompokan Tanpa Pengawasan yang Berarti

Platform Astrolabe secara otomatis memberi label subset sel imun kanonik (Gambar 3). Seperti halnya debarcoding, sangat penting untuk memverifikasi bahwa metode anotasi sel otomatis sesuai dengan definisi historis dengan menghitung tumpang tindih dengan gating manual. Koefisien Korelasi Matthews (MCC) antara kedua metode adalah Ϡ.8 untuk hampir semua himpunan bagian sel (Gambar 3A). Plot biaksial penanda kanonik semakin memperkuat tumpang tindih (Angka Tambahan 2A𠄼). Empat dari himpunan bagian memiliki skor lebih rendah dari 0,8, yang menunjukkan beberapa perbedaan antara pelabelan komputasi dan gating manual. Dalam keempat kasus, ketidaksepakatan itu karena ambang batas subjektif dari penanda tertentu (Gambar 2D Tambahan): ini adalah kasus di mana ambang batas intensitas penanda yang tepat untuk subset yang diberikan ambigu, seperti di mana menggambar garis pada CD24 untuk membedakan Naive dan Sel B Transisi. Yang penting, pendekatan otomatis memungkinkan ambang batas yang konsisten di semua sampel dalam kasus ambigu ini, menghindari potensi subjektivitas manusia dan variabilitas dalam menetapkan gerbang di seluruh sampel.

Gambar 3. Subset sel dan subset profil menggunakan platform Astrolabe. Sel dikelompokkan menggunakan algoritma FlowSOM dan diberi label sesuai dengan hierarki gating kanonik. (A) Plot batang membandingkan pelabelan Astrolabe dengan gating manual di semua subset sel menggunakan Koefisien Korelasi Matthews (MCC). Garis giok sesuai dengan PKS 0,9, garis abu-abu ke PKS 0,8. Hampir semua subset sel memiliki PKS tinggi, yang menunjukkan kesepakatan antara metode otomatis dan manual. (B) Peta panas subset sel untuk satu contoh contoh. Baris adalah himpunan bagian sel, kolom adalah saluran. Intensitas ubin adalah median saluran dalam subset. (C) Plot batang frekuensi subset sel rata-rata di setiap donor. (D) Membuat profil peta panas subset untuk sampel contoh yang sama. (E) Plot batang frekuensi subset profil rata-rata di setiap donor.

Profil intensitas penanda untuk masing-masing himpunan bagian yang diberi label oleh platform sebagian besar mengikuti definisi konsensus HIPC [Gambar 3B, (30)]. Astrolabe secara konsisten mengidentifikasi 11 subset Sel T (termasuk sel T CD4+ dan CD8+, dan masing-masing subset Naive, EMRA, EM dan CM), 6 subset Sel B, beberapa subset myeloid, subset Sel NK, granulosit, dan Sel NKT . Memeriksa frekuensi subset sel di ketiga donor menyoroti variabilitas yang jelas dalam profil kekebalan masing-masing (Gambar 3C), yang selanjutnya memperkuat hasil PCA sebelumnya.

Penemuan subset sel baru yang ditentukan oleh pola ekspresi penanda yang sebelumnya tidak dihargai adalah salah satu janji paling menarik dari sitometri dengan kompleksitas tinggi seperti sitometri massa. Sementara pelabelan subset sel mengikuti tren yang sudah ada, pengelompokan yang tidak diawasi memiliki potensi untuk menggali sinyal yang sebelumnya tidak diketahui. Astrolabe menyertakan langkah pembuatan profil, di mana setiap subset sel yang ditentukan dikelompokkan secara terpisah (Gambar 3D). Jumlah cluster ditentukan melalui heuristik yang bergantung pada jumlah sel di setiap subset dan pada heterogenitas marker. Dalam kumpulan data pewarnaan antibodi, platform mengembalikan 71 subset pembuatan profil, yang kemudian diberi label sesuai dengan penanda atau penanda yang memberikan pemisahan terbesar di antara mereka. Khususnya, beberapa subset Sel T CD8+ dipecah berdasarkan CD161, menunjukkan Sel T seperti MAIT (39). Sel B naif dibedakan berdasarkan IgD, sedangkan Sel NK dipecah menurut CD8. Mirip dengan subset sel kanonik, frekuensi subset profil bervariasi antara tiga donor (Gambar 3E), mengisyaratkan heterogenitas yang lebih luas dalam populasi.

Kumpulan Data Pewarnaan Antibodi Mendefinisikan Pola Ekspresi Ratusan Marker Permukaan Di 71 Subset Sel

Dengan 350 antibodi terukur lebih dari 71 subset profil, set data pewarnaan antibodi adalah sumber informasi yang kaya tentang pola ekspresi yang diharapkan dalam sistem kekebalan yang sehat. Untuk memberikan tampilan awal ke dalam kumpulan data ekspresi penuh, kami menghitung dua metrik untuk setiap subset profil dan kombinasi antibodi (Gambar 4A, Gambar Tambahan 3). Metrik pertama adalah intensitas penanda median, yang paling berguna dalam mendefinisikan ekspresi penanda yang menunjukkan distribusi unimodal dalam subset tertentu. Untuk lebih mencerminkan pola ekspresi bimodal, atau pola di mana hanya sebagian sel yang positif untuk penanda yang diberikan, kami menggunakan sumur kosong yang tidak memiliki antibodi primer PE untuk menetapkan dasar untuk metrik kedua, persen sel positif. Kami menetapkan cutoff sewenang-wenang pada persentil ke-99 dari sumur kosong dan mendefinisikan sel apa pun di atas nilai ini sebagai positif untuk penanda. Peta panas yang dihasilkan memberikan dua statistik ringkasan terpisah dari ekspresi penanda di semua subset pembuatan profil.

Gambar 4. Ringkasan intensitas antibodi LEGENDScreen di semua subset pembuatan profil. (A) Peta panas semua antibodi di semua subset pembuatan profil. Baris adalah antibodi, kolom adalah subset profil. Ukuran ubin adalah persen positif dan intensitas adalah intensitas median. Tiga bagian yang disorot sesuai dengan (B𠄽). (B𠄽) Tampilan lebih besar dari bagian peta panas utama ini. Bagian dipilih untuk secara luas sesuai dengan bagian atas, tengah, dan bawah peta panas. (E) Plot sebar membandingkan intensitas antibodi median antara percobaan LEGENDScreen dan percobaan validasi independen menggunakan sampel donor keempat yang diproses dan diperoleh secara terpisah. Sumbu X adalah intensitas median dalam validasi, sumbu Y adalah intensitas median di Layar LEGENDA. Setiap titik sesuai dengan satu subset sel dan kombinasi antibodi (Pearson's rho adalah 0,78). (F) Plot pencar membandingkan persen positif antara percobaan. Persentase adalah frekuensi penanda di setiap kuadran (Uji Chi-kuadrat McNemar's P-nilai lebih rendah dari 2.2�).

Berfokus pada bagian tertentu dari peta panas mengungkapkan sejumlah besar pola yang relevan. Bagian atas peta diisi dengan penanda mapan (Gambar 4B) seperti CD7, yang ada di semua profil Sel T dan Sel NK, dan CD11b, yang paling banyak diekspresikan oleh monosit. Bagian ini juga menyoroti batasan kumpulan data dengan CD5: sementara ini umumnya dianggap sebagai penanda sel pan-T, layar hanya menunjukkan ekspresi pada Sel T CD4+ Naif, dan bukan Sel T CD4+ lainnya. Pola pewarnaan idiosinkratik ini dapat disebabkan oleh banyak alasan potensial, seperti keterbatasan kit LEGENDScreen, klon antibodi yang digunakan, atau spesifikasi protokol Helios yang kami gunakan. Ini berfungsi sebagai pengingat penting bagi para peneliti yang ingin memanfaatkan sumber daya ini: seperti halnya layar biologis lainnya, sinyal spesifik harus divalidasi lebih lanjut sebelum diandalkan.

Bagian bawah peta panas memungkinkan penyelidikan banyak penanda permukaan yang lebih jarang muncul dalam literatur ilmiah (Gambar 4C). Khususnya, layar mereproduksi ekspresi CD180 dalam Sel B (40) dan ekspresi CD193 dalam basofil (41), sambil mengungkapkan pola potensial baru seperti ekspresi CD181 oleh granulosit dan basofil. Selain itu, banyak penanda diekspresikan oleh himpunan bagian sel myeloid sampai tingkat tertentu. Masih harus dilihat apakah ini merupakan artefak dari teknik eksperimental yang digunakan di sini, atau apakah ada tingkat tinggi heterogenitas sel myeloid yang masih harus ditentukan. Tren ini berlanjut di seluruh peta panas (Gambar 4D), seperti juga beberapa sinyal yang lebih sulit dipahami, seperti CD371, yang memiliki pola ekspresi kotak-kotak di berbagai subset profil yang tampaknya tidak terkait.

Untuk memberikan beberapa validasi luar untuk kumpulan data, kami melakukan percobaan LEGENDScreen independen kedua menggunakan PBMC dari donor keempat dan membandingkan median penanda (Gambar 4E) dan persen positif (Gambar 4F) antara dua percobaan (Tabel Tambahan 4). Metrik berkorelasi antara eksperimen (Pearson's rho masing-masing 0,78 dan 0,73). Untuk persen positif, 88,2% penanda berada di kuadran kiri bawah atau kanan atas plot, menunjukkan kesesuaian yang tinggi antara eksperimen asli dan eksperimen validasi (Uji Chi-kuadrat McNemar's P-nilai lebih rendah dari 2.2�). Bersama-sama, tes ini menunjukkan bahwa tren yang terlihat dalam kumpulan data ini dapat digeneralisasikan. Dengan demikian, tidak seperti kumpulan data utama, CD5 diekspresikan secara seragam di semua subset Sel T dalam data validasi (Gambar Tambahan 4), yang semakin memperkuat pentingnya validasi layar. Meneliti sekumpulan penanda yang jauh dari diagonal tidak mengungkapkan tren yang jelas dan kemungkinan itu adalah hasil dari perbedaan spesifik donor, variasi teknis antara eksperimen, atau gangguan acak.

Beberapa Penanda Diekspresikan Secara Berbeda Antara Sel T CD161+ dan CD161- CD8+

Sumber daya antibodi komprehensif ini menawarkan peluang untuk mengidentifikasi penanda untuk menginterogasi lebih lanjut atau membuat stratifikasi subset sel imun spesifik. Sebagai bukti prinsip pendekatan ini, kami memanfaatkan inklusi CD161 dalam panel pewarnaan antibodi inti, penanda yang sangat diekspresikan pada sel T (MAIT) mukosa terkait (42). Sel MAIT adalah subset dari sel T yang menampilkan kualitas seperti bawaan (43), termasuk rantai TCRα invarian (44) dan kapasitas bawaan untuk merespons infeksi (45). Profil Astrolabe mengidentifikasi subset CD161hi dan CD161lo untuk Sel T Memori Pusat (CM) CD8+ dan Sel T Memori Efektor (EM) CD8+ (Gambar 3D). Subset profil ini dieksplorasi lebih lanjut untuk tren ekspresi penanda diferensial (Gambar 5). Membandingkan persentase metrik positif untuk setiap antibodi dan mencari konsensus di ketiga donor mengidentifikasi enam penanda yang diekspresikan secara berbeda dalam sel CM (Gambar 5A) dan empat penanda dalam sel EM (Gambar 5B).

Gambar 5. Penanda yang diekspresikan secara berbeda antara Sel T CD161+ dan CD161- CD8+. (A,B) Plot sebar menunjukkan persen positif dari setiap penanda dalam berbagai jenis Sel T CD8+. (A) sesuai dengan Memori Pusat (CM), (B) ke Memori Efektor (EM). Sumbu X dan Y adalah persen positif dalam sel CD161- dan CD161+, masing-masing. Setiap titik sesuai dengan satu penanda dalam satu pasien. Garis merah adalah regresi linier. Penanda di mana residu regresi standar absolut adalah Ϣ untuk ketiga donor diwarnai. (C) Plot biaksial dan plot kotak ekspresi CD26 dalam sel CM (kiri) dan EM (kanan). Sumbu X adalah CD161, sumbu Y adalah CD26, setiap titik adalah sel. Sel dan kotak diberi kode warna oleh CD161- (merah) dan CD161+ (biru). (D) Sama untuk ekspresi CD192. Tingkat CD192 dalam monosit (coklat) disediakan sebagai referensi. (E) Sama untuk ekspresi CD183 dalam sel CM. (F) Sama untuk ekspresi CD57 dalam sel EM. (G) Validasi multipleks dari protein yang diekspresikan secara berbeda antara himpunan bagian CD161+ dan CD161- menggunakan sampel PBMC independen. Peta tSNE menyoroti fenotipe dimensi tinggi yang berbeda dari subset sel CD161hi (biru). (H) Plot biaksial menunjukkan validasi ekspresi CD26, CD193, CD183, dan CD57 dalam Sel T CD161- dan CD161+ CD8+.

Dua dari tren ini tumpang tindih antara dua himpunan bagian sel: peningkatan CD26 dan penurunan CD49d. CD26 sebelumnya telah dikaitkan dengan sel MAIT (46). Saat memeriksa anti-PE di CD26 LEGENDScreen dengan baik (Gambar 5C), ada peningkatan rata-rata x4,5 kali lipat antara sel CM CD161- dan CD161+ dan peningkatan x7,2 kali lipat rata-rata antara CD161- dan sel CD161+ EM. Untuk CD49d (Gambar 5D), rata-rata penurunan intensitas adalah x1.2 dan x1.5, masing-masing, yang diharapkan mengingat intensitas rendah keseluruhan untuk penanda itu.

CD192 (CCR2) diekspresikan secara berbeda antara sel CM rendah CD161hi dan CD161, dengan peningkatan rata-rata kali lipat x3,6 dalam subset CD161hi (Gambar 5E, kiri). Itu hanya diekspresikan secara berbeda untuk dua dari tiga donor dalam sel EM (Gambar 5E, kanan). CD192 terlibat dalam perekrutan monosit ke tempat inflamasi (47), sebuah fungsi yang berpotensi dimiliki oleh sel MAIT. Saat memeriksa intensitas penanda pada tingkat sel tunggal, sel CD161hi terletak di antara sel rendah CD161 dan monosit, dan dengan demikian akan diklasifikasikan sebagai CD192mid menggunakan nomenklatur gating standar. Selain penanda ini yang diregulasi secara selektif pada sel CD161hi, layar menyoroti pengurangan ekspresi CD183 pada sel CM CD161hi (Gambar 5F) dan CD57 pada sel CD161hi EM (Gambar 5G).

Salah satu keterbatasan pendekatan skrining ini adalah bahwa masing-masing antibodi diprofilkan secara independen, yang menghalangi analisis koekspresi penanda di layar. Untuk memvalidasi dan mengeksplorasi lebih lanjut pola ko-ekspresi penanda yang diidentifikasi di layar, kami secara independen menodai sampel PBMC donor yang sehat dengan panel yang menggabungkan beberapa penanda yang diekspresikan secara berbeda yang diidentifikasi di layar bersama dengan Va7.2 TCR untuk mengidentifikasi MAIT secara definitif sel (Tabel Tambahan 5). Analisis tSNE pada sel T CD8 yang terjaga keamanannya mengungkapkan bahwa populasi CD161hi memiliki fenotipe yang berbeda dalam ruang dimensi tinggi yang ditentukan oleh ekspresi bersama dari banyak penanda yang diidentifikasi di layar (Gambar 5H dan Gambar Tambahan 5). Pola ekspresi diferensial CD26, CD192, CD183, dan CD57 antara CD161hi dan CD161low sebagian besar mencerminkan yang terlihat di layar awal, secara independen memvalidasi hasil ini (Gambar 5I).

Fiksasi Sampel Menghasilkan Kerugian dan Keuntungan dalam Intensitas Penanda Tertentu

Fiksasi formaldehida adalah pendekatan yang berguna untuk melestarikan sampel sel tetapi telah dikaitkan dengan perubahan epitop permukaan sel dan profil ekspresi penanda [(34, 48), Gambar Tambahan 6]. Namun, mengingat prevalensi dan pentingnya fiksasi dalam percobaan sitometri, ada kebutuhan mendesak untuk studi sistematis tentang efek fiksasi pada intensitas penanda untuk lebih menginformasikan pemilihan penanda dan desain panel dalam studi yang melibatkan sampel tetap.

Kumpulan data pewarnaan antibodi mencakup dua kondisi untuk setiap sampel donor dan antibodi: satu diwarnai segar dan diwarnai setelah fiksasi dengan 1,6% formaldehida. Dua ratus lima puluh lima penanda LEGENDScreen memiliki sel yang intensitasnya lebih tinggi dari ambang batas kosong. Untuk masing-masing penanda ini, kami menghitung rasio antara ekspresi median di setiap kondisi di semua himpunan bagian sel (Gambar 6A). Kami secara sewenang-wenang menetapkan ambang perubahan 2 kali lipat sebagai indikasi pergeseran intensitas yang signifikan antara kondisi. 173 (68%) dari penanda berada di bawah ambang batas yang menunjukkan bahwa mereka tidak terpengaruh oleh fiksasi.

Gambar 6. Penilaian komprehensif dari efek fiksasi pada intensitas penanda. (A) Plot kotak menunjukkan rasio antara intensitas median dalam sampel tetap dan segar. Sumbu X adalah antibodi, diurutkan berdasarkan rasio median, sumbu Y adalah rasio log10. Setiap kotak adalah satu antibodi. Garis abu-abu sesuai dengan nol, atau intensitas median yang sama. (B) Peta panas antibodi tempat sinyal diperoleh dari segar ke tetap (log 10 rasio Ϡ.5). Baris adalah antibodi, kolom adalah himpunan bagian sel. Intensitas ubin adalah perubahan lipatan antara tetap dan segar. (C) Peta panas antibodi di mana sinyal hilang dari segar ke tetap (rasio log 10 lebih rendah dari 𢄠,5). Intensitas ubin adalah perubahan lipatan antara segar dan tetap. (D) Distribusi intensitas untuk dua (subset sel, antibodi) kombinasi di mana median sama antara segar (merah) dan tetap (dalam cyan). Sumbu X adalah intensitas antibodi, sumbu Y adalah kepadatan. Garis putus-putus adalah kuantil ke-99 dari kosong dan menunjukkan latar belakang. Nilai dalam kurung adalah log10(Tetap/Segar) untuk penanda ini dalam subset sel ini. (E) Dua (subset sel, antibodi) kombinasi di mana median meningkat tetap (gain sinyal). (F) Dua (subset sel, antibodi) kombinasi di mana median menurun secara tetap (kehilangan sinyal). (G) Kiri, antibodi CD22 di Basofil, di mana sinyal hilang. Benar, antibodi CD22 dalam Sel B, di mana sinyal tetap konstan. Efek fiksasi berbeda antara himpunan bagian. (H) Plot pencar membandingkan rasio tetap dan segar antara percobaan LEGENDScreen dan percobaan validasi di mana antibodi yang ditunjukkan adalah bagian dari panel sitometri massa (tidak terkonjugasi ke anti-PE). Sumbu X adalah rasio dalam validasi, sumbu Y adalah rasio dalam LEGENDScreen. Each dot is a (cell subset, antibody) combination. Color is antibody, shape is category (gain or loss).

Sixty-five of the markers have a 2-fold or more increase in fixed samples relative to fresh (Figure 6B). In other words, these markers gained additional signal when the sample was fixed. This increase in expression can either be an artifact of fixation or true expression of an antigen that was not detected in the corresponding fresh sample. While formaldehyde fixation may be expected to partially comprise the cell membrane, the samples in this screen were not explicitly treated with any permeabilizing agents, so we do not anticipate significant exposure of intracellular antigens. Furthermore, gains in expression were largely seen across most cell subsets, suggesting that in most cases these reflect non-specific staining artifacts following fixation. At the opposite end of the spectrum, 17 markers showed a 2-fold or more decrease from fresh to fixed and were thus classified as loss of signal (Figure 6C). Since only an existing signal can diminish, the lost pattern is specific to certain subsets.

Examining the ratio between the medians enables a broad survey of all antibodies over all subsets. However, it ignores the single-cell nature of the data. Closer examination of several marker intensity distributions reveals that when the ratio is around zero, the underlying distribution is usually maintained from fresh to fixed as well (Figure 6D). When marker intensity is gained, it typically only affects some of the cells within the subsets, while the low expression persists in others (Figure 6E). On the other hand, when signal is lost, it appears that fixation diminishes it completely (Figure 6F). These trends further reinforce the hypothesis that the signal gained by fixation is due to the protocol rather than the underlying biology. In almost all cases, changes in markers expression patterns showed similar trends across subsets expressing that marker. One notable expression was CD22, which was found to be expressed on both B cells and basophils in the fresh samples using the clone contained in the Legendscreen panel (S-HCL-1), consistent with previous descriptions of clone-specific CD22 expression on basophils (49, 50). However, fixation resulted in loss of expression specifically on basophils, but not on B cells (Figure 6G), reflecting differences in the fixation sensitivity of the CD22 conformational epitopes that are differentially expressed between B cells and basophils (51).

The LEGENDScreen kit includes antibodies conjugated to PE which are then measured by mass cytometry using an anti-PE secondary. It is possible that the effects of fixation observed here are not due to effects on the underlying antibody, but rather due to a more complex interaction that potentially includes the marker antibody, PE, and anti-PE. We therefore performed a validation experiment where seven of the gain or loss markers were incorporated into the mass cytometry panel (Figure 6H). For the three loss markers, the validation results confirm the effect we saw in the data set: the same subsets express these markers, and loss their signal after fixation. On the other hand, the results for the gain markers were mixed. While one of them (CXCR3) fully reproduced the screen results, the other two only lost their signal in some of the cell subsets.

Cytometry experiment design can be a daunting task due to the high number of variables that needs to be considered. There are many factors that could influence results in unknown ways, especially when employing a method such as fixation that has the potential to perturb the chemistry and kinetics underlying the assay. This antibody staining data set represents an accessible resource to identify and anticipate such potential effects.


Development of a Comprehensive Antibody Staining Database using a Standardized Analytics Pipeline

Large-scale immune monitoring experiments (such as clinical trials) are a promising direction for biomarker discovery and responder stratification in immunotherapy. Mass cytometry is one of the tools in the immune monitoring arsenal. We propose a standardized workflow for the acquisition and analysis of large-scale mass cytometry experiments. The workflow includes two-tiered barcoding, a broad lyophilized panel, and the incorporation of a fully automated, cloud-based analysis platform. We applied the workflow to a large antibody staining screen using the LEGENDScreen kit, resulting in single-cell data for 350 antibodies over 71 profiling subsets. The screen recapitulates many known trends in the immune system and reveals potential markers for delineating MAIT cells. Additionally, we examine the effect of fixation on staining intensity and identify several markers where fixation leads to either gain or loss of signal. The standardized workflow can be seamlessly integrated into existing trials. Finally, the antibody staining data set is available as an online resource for researchers who are designing mass cytometry experiments in suspension and tissue.


What We Offer:

The non-immunogenic character of HS makes this type of antibody difficult to raise, so the few hybridoma-derived mouse anti-HS antibodies such as JM403, 10E4 and 3G10 are valuable tools for HS research. Using any of our multiple HS antibodies that recognize subtle differences in HS patterning can be useful in applications such as flow cytometry allowing multiple cell types to be directly compared.

Fig. Proteoglycan structure with GAG chains linking from a core protein

AMSBIO offers quality heparan sulfate antibodies from the important clones (JM403, 10E4 and 3G10), which are ideal to the binding of HS for HSPG research. AMSBIO also provides various anti-HS antibodies, recognizing distinct HS substructures and well characterized in previous studies.

How 10E4, JM403, 3G10 antibodies and heparinase III enzymes work together

Fig. 1. Reactivity of 10E4, b) Reactivity of 3G10, c) Sensitivity of 10E4 and 3G10 to HSase.

Clones 10E4 and JM403 recognize common epitopes on heparan sulfate (HS), which can be found on both basement membrane and cell-associated HS species. The 3G10 clone recognizes a neo-epitope exposed by digestion with heparinase III (HSase I) enzyme as seen in figure 3 (which destroys reactivity to 10E4 and JM-403) so that the 3G10 clone can be used as control to 10E4 or JM-403 (and vice versa).


Build effective multicolor panels

When the emission spectra of two fluorophores overlap, spill over of one fluorophore into the detection channel of the other might be observed (e.g. FITC and PE). This can make it difficult to identify discrete populations without the use of spill over correction by a technique called compensation. Where possible, the spill over can be minimized by selecting fluorophores that have little or no overlap, however this is not always possible when using several fluorophores. A spectrum viewer can assist in obtaining the best fit emission profiles. Using fluorophores with little or no overlap for cell subset markers (e.g. T cell subsets) and closely overlapping fluorophores for mutually exclusive markers (such as CD3 and CD19) can prevent reduced sensitivity due to fluorescence spread.


Ethics declarations

Ethics approval and consent to participate

Not applicable for this study.

Competing interests

MS, PS and BHL have filed a patent application based on this work (US provisional patent application 62/515-180). BZY is an employee at BioLegend Inc., which is the exclusive licensee of the New York Genome Center patent application related to this work. All other authors declare that they have no competing interests.

Publisher’s Note

Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi institusional.


Tonton videonya: Labventure arfiant pewarnaan IHC hari ke-2 (Juni 2022).


Komentar:

  1. Daimmen

    Between us speaking, I would ask the help for users of this forum.

  2. Mohamet

    Super! Terima kasih: 0

  3. Dareau

    itu memang aneh

  4. Taymullah

    Saya memberi selamat tentang ide yang sangat bagus ini

  5. Mwaka

    Menurut pendapat saya Anda tidak benar. Mari kita bahas. Menulis kepada saya di PM, kita akan bicara.

  6. Eoforwic

    Menurut saya Anda keliru. Mari kita bahas. Menulis kepada saya di PM, kita akan bicara.



Menulis pesan