Informasi

Bagaimana cara memperkirakan kepadatan DNA di kepala sperma manusia?

Bagaimana cara memperkirakan kepadatan DNA di kepala sperma manusia?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya telah mendapat perkiraan volume kepala sperma dari internet. Seperti menganggapnya sebagai piringan berukuran 4-5µm. Sekarang saya ingin menemukan kepadatan DNA di kepala sperma. Bagaimana menemukan itu?


Temukan, atau hitung, nilai volume kepala sperma.

Temukan nilai untuk ukuran genom manusia (haploid atau diploid?)

Ubah ukuran genom, yang mungkin akan dalam pasangan basa Giga, menjadi massa (saya sarankan pikogram).

Bagi massa dengan volume untuk mendapatkan kerapatan, pg m-3

Penyempurnaan - apakah inti sperma mengambil semua volume kepala? Apakah Anda perlu memperhitungkan ini?


Kandungan DNA Mitokondria Spermatozoa Manusia

Pekerjaan ini didukung oleh hibah dari Spanyol Fondo de Investigaciones Sanitarias (98/1033 dan 01/0192).

Carmen Díez-Sánchez, Eduardo Ruiz-Pesini, Ana Cristina Lapeña, Julio Montoya, Acisclo Pérez-Martos, José Antonio Enríquez, Manuel J. López-Pérez, Kandungan DNA mitokondria Spermatozoa Manusia, Biologi Reproduksi, Volume 68, Edisi 1, 1 Januari 2003, Halaman 180–185, https://doi.org/10.1095/biolreprod.102.005140


Isi

Alasan paling umum untuk analisis air mani laboratorium pada manusia adalah sebagai bagian dari penyelidikan infertilitas pasangan dan setelah vasektomi untuk memverifikasi bahwa prosedur itu berhasil. [4] Hal ini juga biasa digunakan untuk menguji donor manusia untuk donasi sperma, dan untuk analisis semen hewan biasanya digunakan dalam peternakan pejantan dan peternakan hewan.

Kadang-kadang seorang pria akan melakukan analisis air mani sebagai bagian dari tes pra-kehamilan rutin. Di tingkat laboratorium hal ini jarang terjadi, karena sebagian besar penyedia layanan kesehatan tidak akan menguji air mani dan sperma kecuali jika diminta secara khusus atau ada kecurigaan kuat adanya patologi di salah satu area ini yang ditemukan selama riwayat medis atau selama pemeriksaan fisik. Pengujian semacam itu sangat mahal dan memakan waktu, dan di AS tidak mungkin ditanggung oleh asuransi. Di negara lain, seperti Jerman, pengujian ditanggung oleh semua asuransi.

Karakteristik yang diukur dengan analisis semen hanyalah sebagian dari faktor kualitas semen. Salah satu sumber menyatakan bahwa 30% pria dengan analisis air mani normal sebenarnya memiliki fungsi sperma yang tidak normal. [5] Sebaliknya, pria dengan hasil analisis air mani yang buruk dapat menjadi ayah dari anak-anak. [6] Dalam pedoman NICE, infertilitas faktor pria ringan didefinisikan sebagai ketika 2 atau lebih analisis air mani memiliki 1 atau lebih variabel di bawah persentil ke-5, dan memberikan kemungkinan kehamilan terjadi secara alami melalui hubungan seksual dalam waktu 2 tahun mirip dengan orang dengan endometriosis ringan. [7]

Metode pengumpulan semen meliputi masturbasi, pengumpulan kondom, dan ekstraksi epididimis. Sampel tidak boleh diperoleh melalui koitus interuptus karena beberapa bagian dari ejakulasi dapat hilang, kontaminasi bakteri dapat terjadi, atau pH vagina yang asam dapat merusak motilitas sperma. Pantang seksual yang optimal untuk pengambilan sampel air mani adalah 2 hingga 7 hari. Cara paling umum untuk mendapatkan sampel air mani adalah melalui masturbasi dan tempat terbaik untuk mendapatkannya adalah di klinik di mana analisis akan dilakukan untuk menghindari perubahan suhu selama transportasi yang dapat mematikan bagi beberapa spermatozoa. Setelah sampel diperoleh, sampel harus langsung dimasukkan ke dalam wadah plastik steril (tidak pernah dalam pengawet konvensional, karena mengandung bahan kimia seperti pelumas atau spermisida yang dapat merusak sampel) dan diserahkan ke klinik untuk dipelajari. dalam waktu satu jam.

Ada beberapa situasi di mana perolehan khusus diperlukan, seperti ejakulasi mundur, cedera neurologis atau hambatan psikologis. Tergantung pada situasinya, kita dapat menggunakan metode yang berbeda seperti pengawet khusus, stimulasi elektro, stimulasi vibro, dll.

Contoh parameter yang diukur dalam analisis semen adalah: jumlah sperma, motilitas, morfologi, volume, kadar fruktosa dan pH.

Mengedit jumlah sperma

Jumlah sperma, atau konsentrasi sperma untuk menghindari kebingungan dengan jumlah sperma total, mengukur konsentrasi sperma dalam ejakulasi pria, dibedakan dari jumlah sperma total, yaitu jumlah sperma dikalikan dengan volume. Lebih dari 15 juta sperma per mililiter dianggap normal, menurut WHO pada tahun 2010. [8] Definisi lama menyatakan 20 juta. [5] [6] Jumlah sperma yang lebih rendah dianggap oligozoospermia. Vasektomi dianggap berhasil jika sampelnya azoospermia (tidak ditemukan sperma dalam bentuk apa pun). Ketika sampel mengandung kurang dari 100.000 spermatozoa per mililiter, kita berbicara tentang criptozoospermia. Beberapa mendefinisikan kesuksesan sebagai ketika sperma non-motil langka/sesekali diamati (kurang dari 100.000 per mililiter). [9] Lainnya menganjurkan untuk mendapatkan analisis air mani kedua untuk memverifikasi jumlah tidak meningkat (seperti yang dapat terjadi dengan kanalisasi ulang) dan yang lain masih dapat melakukan vasektomi berulang untuk situasi ini.

Keripik untuk digunakan di rumah muncul yang dapat memberikan perkiraan jumlah sperma yang akurat setelah tiga sampel diambil pada hari yang berbeda. Chip tersebut dapat mengukur konsentrasi sperma dalam sampel air mani terhadap cairan kontrol yang diisi dengan manik-manik polistiren. [10] [ sumber medis yang tidak dapat diandalkan? ]

Sunting Motilitas

Organisasi Kesehatan Dunia memiliki nilai 40 [11] % dan ini harus diukur dalam waktu 60 menit setelah pengumpulan. WHO juga memiliki parameter daya hidup, dengan batas referensi lebih rendah 60% spermatozoa hidup. [8] Seorang pria dapat memiliki jumlah sperma jauh melebihi batas >15 juta sel sperma per mililiter, tetapi masih memiliki kualitas yang buruk karena terlalu sedikit dari mereka yang motil. Namun, jika jumlah sperma sangat tinggi, maka motilitas yang rendah (misalnya, kurang dari 60%) mungkin tidak masalah, karena fraksinya mungkin masih lebih dari 8 juta per mililiter. Sebaliknya, seorang pria dapat memiliki jumlah sperma jauh kurang dari 20 juta sel sperma per mililiter dan masih memiliki motilitas yang baik, jika lebih dari 60% sel sperma yang diamati menunjukkan gerakan maju yang baik - yang bermanfaat karena alam lebih menyukai kualitas daripada kuantitas.

Ukuran yang lebih spesifik adalah tingkat motilitas, dimana total motilitas(PR+NP) dan immotil [12]

Gerak maju- Sperma yang bergerak maju adalah Gerak Progresif Tidak Motil-Sperma yang bergerak melingkar tidak Gerak Maju Imotil- Sperma tersebut gagal bergerak atau sperma mati.

Sampel semen yang memiliki motilitas progresif lebih dari 32% dianggap sebagai normozoospermia. Sampel di bawah nilai tersebut diklasifikasikan sebagai asthenozoospermia menurut kriteria WHO.

Morfologi Sunting

Mengenai morfologi sperma, kriteria WHO seperti yang dijelaskan pada tahun 2010 menyatakan bahwa sampel normal (sampel dari pria yang pasangannya pernah hamil dalam 12 bulan terakhir) jika 4% (atau persentil ke-5) atau lebih dari sperma yang diamati memiliki morfologi normal. [8] [13] Jika sampel memiliki kurang dari 4% spermatozoa normal secara morfologi, itu diklasifikasikan sebagai teratozoospermia.

Morfologi sperma yang normal sulit untuk diklasifikasikan karena kurangnya objektivitas dan variasi interpretasi, misalnya. Untuk mengklasifikasikan spermatozoa sebagai normal atau abnormal, bagian-bagian yang berbeda harus dipertimbangkan. Sperma memiliki kepala, bagian tengah dan ekor.

Pertama, kepala harus berbentuk oval, halus dan dengan garis yang teratur. Terlebih lagi, wilayah akrosom harus terdiri dari 40-70% area kepala, didefinisikan dan tidak mengandung vakuola besar. Jumlah vakuola tidak boleh melebihi 20% dari luas kepala. Panjangnya harus 4-5μm dan lebar 2,5-3,5μm.

Kedua, bagian tengah dan leher harus teratur, dengan lebar maksimal 1 m dan panjang 7-8μm. Sumbu bagian tengah harus sejajar dengan sumbu utama kepala.

Akhirnya, ekor harus lebih tipis dari bagian tengah dan memiliki panjang kira-kira 45μm dan diameter konstan sepanjang panjangnya. Adalah penting bahwa itu tidak digulung.

Karena kelainan sering bercampur, indeks teratozoospermia (TZI) sangat membantu. Indeks ini adalah jumlah rata-rata kelainan per sperma abnormal. Untuk menghitungnya, 200 spermatozoa dihitung (ini angka yang bagus). Dari jumlah tersebut dihitung kelainan pada kepala, bagian tengah dan ekor, serta jumlah spermatozoa yang abnormal. Setelah tugas itu selesai, TZI dihitung seperti ini:

  • x = jumlah spermatozoa abnormal.
  • h = jumlah spermatozoa dengan kelainan kepala.
  • m = jumlah spermatozoa dengan kelainan midpiece.
  • t = jumlah spermatozoa dengan kelainan ekor.

Indeks lain yang menarik adalah indeks deformitas sperma (SDI), yang dihitung dengan cara yang sama seperti TZI, tetapi bukannya membagi dengan jumlah spermatozoa abnormal, pembagiannya adalah dengan jumlah total sperma yang dihitung. TZI mengambil nilai dari 1 (hanya satu kelainan per sperma) hingga 3 (setiap sperma memiliki tiga jenis kelainan).

Morfologi merupakan prediktor keberhasilan pembuahan oosit selama fertilisasi in vitro.

Hingga 10% dari semua spermatozoa memiliki cacat yang dapat diamati dan karena itu kurang beruntung dalam hal pembuahan oosit. [14]

Selain itu, sel sperma dengan pola pembengkakan ujung ekor umumnya memiliki frekuensi aneuploidi yang lebih rendah. [15]

A pemeriksaan morfologi organel sperma motil (MSOME) adalah penyelidikan morfologi tertentu di mana mikroskop cahaya terbalik dilengkapi dengan optik daya tinggi dan ditingkatkan dengan pencitraan digital digunakan untuk mencapai perbesaran di atas x6000, yang jauh lebih tinggi daripada perbesaran yang biasa digunakan oleh ahli embriologi dalam seleksi spermatozoa untuk sperma intracytoplasmic injeksi (x200 hingga x400). [16] Temuan potensial pada MSOME adalah adanya vakuola sperma, yang berhubungan dengan ketidakdewasaan kromatin sperma, terutama dalam kasus vakuola besar. [17]

Pengeditan Volume

Menurut salah satu tes laboratorium volume air mani manual antara 2,0 mL dan 5 mL adalah normal [6] WHO menganggap 1,5 ml sebagai batas referensi yang lebih rendah. [8] Volume rendah yang disebut Hypospermia, dapat menunjukkan penyumbatan sebagian atau seluruhnya dari vesikula seminalis, atau bahwa pria itu lahir tanpa vesikula seminalis. [5] Dalam praktek klinis, volume kurang dari 0,5mL dalam pengaturan infertilitas kemungkinan besar karena ejakulasi tidak lengkap atau kehilangan sebagian sampel, selain itu, pasien harus dievaluasi untuk hipoandrogenisme dan azoospermia obstruktif mengingat telah setidaknya 48 jam sejak ejakulasi terakhir hingga waktu pengambilan sampel.

Ejakulasi manusia sebagian besar terdiri dari air, 96 hingga 98% air mani adalah air. Salah satu cara untuk memastikan bahwa seorang pria menghasilkan lebih banyak ejakulasi [18] adalah dengan minum lebih banyak cairan. Pria juga menghasilkan lebih banyak cairan mani setelah rangsangan dan gairah seksual yang lama. Mengurangi frekuensi seks dan masturbasi membantu meningkatkan volume air mani. Penyakit menular seksual juga mempengaruhi produksi air mani. Pria yang terinfeksi [19] dengan human immunodeficiency virus (HIV) menghasilkan volume air mani yang lebih rendah.

Volume air mani juga dapat meningkat, suatu kondisi yang dikenal sebagai hiperspermia. Volume lebih besar dari 6mL dapat mengindikasikan peradangan prostat. Bila tidak ada volume, kondisi ini disebut aspermia, yang dapat disebabkan oleh ejakulasi retrograde, penyakit anatomi atau saraf, atau obat antihipertensi.

Pengeditan Warna

Semen biasanya berwarna abu-abu keputihan. Itu cenderung mendapatkan warna kekuningan seiring bertambahnya usia pria. Warna air mani juga dipengaruhi oleh makanan yang kita makan: makanan yang mengandung belerang tinggi, seperti bawang putih, dapat menyebabkan pria memproduksi air mani berwarna kuning. [20] Adanya darah dalam air mani (hematospermia) menyebabkan ejakulasi berwarna kecoklatan atau merah. Hematospermia adalah kondisi yang jarang terjadi.

Air mani yang memiliki warna kuning tua atau kehijauan dalam penampilan mungkin karena pengobatan. Air mani coklat terutama merupakan hasil dari infeksi dan peradangan kelenjar prostat, uretra, epididimis dan vesikula seminalis. [ kutipan diperlukan ] Penyebab lain dari warna air mani yang tidak biasa termasuk infeksi menular seksual seperti gonore dan klamidia, operasi genital dan cedera pada organ seks pria.

Tingkat fruktosa Sunting

Tingkat fruktosa dalam air mani dapat dianalisis untuk menentukan jumlah energi yang tersedia untuk air mani untuk bergerak. [6] WHO menetapkan tingkat normal 13 mol per sampel. Tidak adanya fruktosa dapat mengindikasikan masalah dengan vesikula seminalis. [5]

Pengeditan pH

Menurut satu tes laboratorium manual kisaran pH normal adalah 7,1-8,0 [6] kriteria WHO menentukan normal sebagai 7,2-7,8. [5] Ejakulasi asam (nilai pH lebih rendah) dapat mengindikasikan satu atau kedua vesikula seminalis tersumbat. Ejakulasi dasar (nilai pH yang lebih tinggi) dapat mengindikasikan infeksi. [5] Nilai pH di luar kisaran normal berbahaya bagi sperma dan dapat memengaruhi kemampuannya untuk menembus sel telur. [6] Hasil pH akhir dari keseimbangan antara nilai pH sekresi kelenjar aksesori, sekresi vesikula seminalis basa dan sekresi prostat asam. [21]

Likuifaksi Sunting

Pencairan adalah proses ketika gel yang dibentuk oleh protein dari vesikula seminalis pecah dan air mani menjadi lebih cair. Biasanya dibutuhkan waktu kurang dari 20 menit untuk sampel berubah dari gel kental menjadi cairan. Dalam pedoman NICE, waktu pencairan dalam 60 menit dianggap dalam kisaran normal. [22]

Editan MOT

MOT adalah ukuran berapa juta sel sperma per ml yang sangat motil, [23] yaitu, kira-kira kelas a (>25 mikrometer per 5 detik pada suhu kamar) dan kelas b (>25 mikrometer per 25 detik pada suhu kamar ). Jadi, ini adalah kombinasi dari jumlah sperma dan motilitas.

Dengan sedotan [24] atau volume botol 0,5 mililiter, pedoman umum adalah bahwa, untuk inseminasi intraserviks (ICI), sedotan atau botol yang membuat total 20 juta spermatozoa motil direkomendasikan. Ini sama dengan 8 sedotan atau vial 0,5 ml dengan MOT5, atau 2 sedotan atau vial MOT20. Untuk inseminasi intrauterin (IUI), 1-2 sedotan atau vial MOT5 dianggap cukup. [25] Dalam istilah WHO, disarankan untuk menggunakan sekitar 20 juta sperma grade a+b di ICI, dan 2 juta grade a+b di IUI.

Kerusakan DNA Sunting

Kerusakan DNA pada sel sperma yang berhubungan dengan infertilitas dapat diselidiki dengan analisis kerentanan DNA terhadap denaturasi sebagai respons terhadap perlakuan panas atau asam [26] dan/atau dengan deteksi fragmentasi DNA yang ditunjukkan dengan adanya double-strand break yang dideteksi oleh uji TUNEL. [27] [28] Teknik lain yang dilakukan untuk mengukur fragmentasi DNA adalah: SCD (uji dispersi kromatin sperma), ISNT (di tempat terjemahan nick), SCSA (uji struktural kromatin sperma) dan uji komet.

Jumlah spermatozoa motil Sunting

Jumlah spermatozoa motil (TMS) [29] atau jumlah sperma motil total (TMSC) [30] adalah kombinasi dari jumlah sperma, motilitas dan volume, mengukur berapa juta sel sperma di seluruh ejakulasi yang motil.

Penggunaan sekitar 20 juta sperma dengan motilitas grade c atau d di ICI, dan 5 juta di IUI mungkin merupakan rekomendasi perkiraan.

Lainnya Sunting

Sampel juga dapat diuji untuk sel darah putih. Tingkat sel darah putih yang tinggi dalam air mani disebut leukospermia dan dapat mengindikasikan infeksi. [5] Cutoff dapat bervariasi, tetapi contoh cutoff adalah lebih dari 1 juta sel darah putih per mililiter air mani. [5]

    : tidak adanya air mani : tidak adanya sperma : volume air mani rendah : volume air mani tinggi : Jumlah sperma sangat rendah : motilitas sperma buruk : sperma membawa lebih banyak cacat morfologi dari biasanya : semua sperma dalam ejakulasi mati
  • Leukospermia: tingkat sel darah putih yang tinggi dalam air mani

Terlepas dari kualitas semen itu sendiri, ada berbagai faktor metodologis yang dapat mempengaruhi hasil, sehingga menimbulkan variasi antar metode.

Dibandingkan dengan sampel yang diperoleh dari masturbasi, sampel air mani dari kondom koleksi memiliki jumlah sperma total, motilitas sperma, dan persentase sperma dengan morfologi normal yang lebih tinggi. kutipan diperlukan ] . Untuk alasan ini, mereka diyakini memberikan hasil yang lebih akurat ketika digunakan untuk analisis air mani.

Jika hasil dari sampel pertama seorang pria subfertil, mereka harus diverifikasi dengan setidaknya dua analisis lagi. Setidaknya 2 sampai 4 minggu harus diperbolehkan antara setiap analisis. [31] [ kutipan medis diperlukan ] Hasil untuk pria lajang mungkin memiliki sejumlah besar variasi alami dari waktu ke waktu, yang berarti satu sampel mungkin tidak mewakili karakteristik rata-rata air mani pria. [ kutipan medis diperlukan ] Selain itu, ahli fisiologi sperma Joanna Ellington percaya bahwa stres menghasilkan sampel ejakulasi untuk pemeriksaan, seringkali dalam pengaturan yang tidak dikenal dan tanpa pelumasan (kebanyakan pelumas agak berbahaya bagi sperma), dapat menjelaskan mengapa sampel pertama pria sering menunjukkan hasil yang buruk sementara sampel kemudian menunjukkan hasil yang normal. [ kutipan medis diperlukan ]

Seorang pria mungkin lebih suka membuat sampelnya di rumah daripada di klinik. Situs pengumpulan air mani tidak bukan mempengaruhi hasil analisis air mani.. [32] Jika diproduksi di rumah sampel harus disimpan sedekat mungkin dengan suhu tubuh karena paparan kondisi dingin atau hangat dapat mempengaruhi motilitas sperma

Volume dapat ditentukan dengan mengukur berat wadah sampel, mengetahui massa wadah kosong. Jumlah sperma dan morfologi dapat dihitung dengan mikroskop. Jumlah sperma juga dapat diperkirakan dengan alat yang mengukur jumlah protein terkait sperma, dan cocok untuk digunakan di rumah. [33] [ sumber medis yang tidak dapat diandalkan? ]

Analisis air mani dengan bantuan komputer (CASA) adalah frasa umum untuk teknik analisis semen otomatis atau semi-otomatis. Sebagian besar sistem didasarkan pada analisis gambar, tetapi ada metode alternatif seperti melacak pergerakan sel pada tablet digitalisasi. [34] [35] Teknik berbantuan komputer paling sering digunakan untuk penilaian konsentrasi sperma dan karakteristik mobilitas, seperti kecepatan dan kecepatan linier. Saat ini, ada sistem CASA, berdasarkan analisis gambar dan menggunakan teknik baru, dengan hasil yang hampir sempurna, dan melakukan analisis penuh dalam beberapa detik. Dengan beberapa teknik, pengukuran konsentrasi dan motilitas sperma setidaknya dapat diandalkan seperti metode manual saat ini. [36]

Spektroskopi Raman telah membuat kemajuan dalam kemampuannya untuk melakukan karakterisasi, identifikasi dan lokalisasi kerusakan DNA inti sperma. [37]


AP Biologi

Semua elemen yang saat ini diketahui sains—dan beberapa yang diprediksi ada tetapi masih belum ditemukan—terorganisir dalam sebuah tabel yang disebut tabel periodik. Organisasi unsur-unsur tidak acak Ilmuwan dapat memprediksi sifat kimia unsur berdasarkan di mana mereka jatuh dalam tabel periodik.

Setiap elemen diwakili oleh satu persegi. Singkatan satu atau dua huruf untuk setiap elemen juga tercantum dalam kotak. Selain itu, setiap elemen memiliki nomor, yang dikenal sebagai nomor atom, yang sesuai dengan jumlah proton yang ditemukan dalam nukleus.

Perhatikan bahwa angka mulai dari 1 di sudut kiri atas tabel dan meningkat dari kiri ke kanan melintasi baris. Jika ada celah di baris, angkanya masih melompat langsung.

Sebagian besar merkuri di Bumi terperangkap dalam batuan dan dilepaskan secara alami melalui proses geologis. Namun, aktivitas manusia menyebabkan sejumlah besar merkuri dilepaskan ke atmosfer. Peningkatan keluaran polutan ini menempatkan lingkungan dan manusia pada risiko yang lebih besar.

1) KONDISI SANGAT ASAM ATAU DASAR:- Kondisi asam atau basa yang tinggi dapat menyebabkan pelepasan protein yang akan mendistorsi strukturnya yang mengarah ke denaturasinya.

2) KONSENTRASI GARAM TINGGI: - Konsentrasi garam yang tinggi dapat menghilangkan lapisan air dari molekul protein yang menyebabkan denaturasi.

3) PANAS TINGGI: - Panas tinggi mengguncang untaian protein yang menyebabkan kerusakan protein kompleks, dan protein yang terlepas akan menempel dan membentuk struktur yang lebih kompleks.

Lipid ini terdiri dari dua ekor asam lemak yang terikat pada gugus fosfat.
jenis lipid: fosfolipid.

Lipid inilah yang menutupi banyak permukaan tanaman untuk membantu mencegah kehilangan air dan melindungi dari hama.
jenis lipid: Lilin.

Sel secara individual hidup dan merupakan unit struktural dan fungsional dasar kehidupan.

Jenis protein membran: protein adhesi

Fungsi protein membran: Mengikat zat tertentu di luar sel

Jenis protein membran: protein reseptor

Fungsi protein membran: Membantu ion atau molekul tertentu melintasi membran melalui transpor aktif atau pasif


Diskusi

Dalam karya ini, kami menyadari jaringan yang mewakili dugaan Human Spermatozoa Interactome (HSIN3.0 dan HSIN3.0_MC), mulai dari data proteomik yang dipublikasikan. Setelah memperoleh model jaringan, kami menilai topologinya untuk menyimpulkan informasi biologis yang penting. Pertama, terbukti bahwa HSIN3.0 dan HSIN3.0_MC dicirikan oleh topologi tertentu: mereka adalah jaringan bebas skala sesuai dengan model Barabasi-Albert (BA). Mereka dicirikan oleh heterogenitas yang luas dari tingkat node node. Secara khusus, dalam jaringan BA sejumlah kecil node yang sangat terhubung ("hubs") hidup berdampingan dengan jumlah node yang hampir tidak terhubung yang lebih tinggi [18]. Dari sudut pandang dinamis, jaringan ini tumbuh dari waktu ke waktu, karena perlekatan node baru secara istimewa ke hub: semakin banyak satu node terhubung, semakin tinggi kemungkinan ia menarik node baru (preferensial attachment) [19 ]. Jadi, peluang P Saya bahwa simpul baru terhubung ke simpul Saya adalah:

di mana k Saya adalah derajat simpul Saya dan jumlahnya dibuat untuk semua node yang sudah ada sebelumnya J [19, 20]. Akhirnya, derajat node dari node dalam jaringan mengikuti distribusi hukum daya, yaitu probabilitas bahwa sebuah node memiliki k link berikut P(k)

k , di mana pangkat eksponen biasanya berkisar antara 2 dan 3. Berbeda dari model jaringan bebas skala lainnya seperti jaringan hierarkis, dalam jaringan BA koefisien pengelompokan, C(k), tidak bergantung pada k dan panjang jalan rata-rata mengikuti aku

Dalam konteks ini, kami mencari node yang paling terhubung, untuk mengidentifikasi molekul yang relevan secara biologis. Analisis hub menawarkan informasi yang sangat menarik dan data yang sangat menggugah pikiran. Memang, bersama dengan molekul yang dikenal sebagai komponen sel di mana-mana (seperti halnya ATP) atau sebagai modulator fisiologi sperma (lihat misalnya Ca 2+ ), kami menemukan beberapa simpul yang tidak terduga. Mereka mewakili molekul yang secara khusus terlibat dalam fungsi yang dianggap tidak ada atau tidak aktif dalam sel sperma, seperti kontrol siklus sel, sintesis protein, perdagangan nuklir, dan respons imun. Dalam semua kasus ini, akan sangat penting untuk mengeksplorasi fungsi-fungsi ini pada spermatozoa untuk memverifikasi makna biologis yang sebenarnya dari hasil ini. Bagaimanapun, penelitian ini, dengan studi proteomik lainnya (lihat referensi [7]), berpotensi membuka perspektif baru pada studi biologi sperma.

Sampai saat ini tidak semua peneliti setuju dalam definisi hub dan pendapat univokal pada kepatutan topologi dan fungsional tidak ada [22]. Bagaimanapun, data kami tampaknya menunjukkan bahwa dalam jaringan Interactome sperma akan memungkinkan untuk membedakan hub yang terlibat dalam kontrol berbagai fungsi dan hub yang ditujukan untuk mengendalikan fungsi tertentu. Sesuai dengan Han et al. [23] kami menganalisis nilai koefisien pengelompokan dari node yang paling terhubung dalam jaringan (hub) melakukan estimasi kepadatan kernel. Hasilnya, kami mengidentifikasi subpopulasi node yang berbeda (lihat File tambahan 3). Yang lebih besar dicirikan oleh nilai parameter ini yang sangat rendah, mulai dari 0 hingga sekitar 0,17, sedangkan yang lainnya lebih kecil dan koefisien clusternya secara signifikan lebih tinggi, dari 0,83 hingga 0,89. Ada kemungkinan untuk berspekulasi bahwa pengelompokan hub yang berbeda dapat dikaitkan dengan makna fungsional yang berbeda dari molekul yang sesuai dalam fisiologi sperma. Perbedaan ini tampaknya sesuai dengan hipotesis Han dan rekan, yang mendefinisikan dua jenis hub yang berbeda “hub 'pesta', yang berinteraksi dengan sebagian besar mitra mereka secara bersamaan [dan yang ditandai dengan nilai koefisien pengelompokan yang lebih rendah], dan hub 'tanggal', yang mengikat mitra mereka yang berbeda pada waktu atau lokasi yang berbeda [dan yang menampilkan nilai koefisien pengelompokan yang lebih tinggi]” [23].

Misalnya, di sini, hub pihak yang paling penting (dalam hal derajat simpul) adalah ATP, yang jelas terlibat dalam berbagai reaksi kimia di waktu dan lokasi subseluler yang berbeda, sehingga berperilaku sebagai hub umum. Sebagai substrat energi, dalam sel germinal laki-laki ATP diproduksi oleh glikolisis dan fosforilasi oksidatif mitokondria, dua jalur metabolisme utama yang diekspresikan dalam spermatozoa yang terlokalisasi di sub-kompartemen seluler yang berbeda: glikolisis terjadi terutama di selubung fibrosa flagel tempat enzim glikolitik berada. erat berlabuh, sementara fosforilasi oksidatif terjadi di mitokondria, di bagian tengah sperma [24]. Penggunaan preferensial dari satu jalur sangat spesifik spesies [25].

Subpopulasi kedua (pusat tanggal) dicirikan oleh klasterisasi yang langka dan dengan kehadiran anggota keluarga interferon. Seperti yang diketahui dalam sel somatik, interferon terlibat dalam respon imun, yang dilepaskan di hadapan patogen seperti virus, bakteri, dan parasit. Selain itu, interferon mengaktifkan sel-sel kekebalan, seperti sel pembunuh alami dan makrofag, dan mampu meningkatkan pertahanan inang dengan mengatur presentasi antigen. Fungsinya dalam spermatozoa belum banyak dipelajari, dan hanya ada sedikit laporan tentang aktivitas biologisnya dalam sel germinal jantan dewasa. Selama spermatogenesis, diduga bahwa INF dapat memainkan peran kunci, seperti yang disarankan oleh Hibi et al. [26] yang menemukan bahwa pemberian -IFN meningkatkan spermatogenesis testis dan meningkatkan konsentrasi sperma epididimis pada tikus. Menariknya, mereka juga menemukan bahwa motilitas progresif spermatozoa tidak terpengaruh oleh pengobatan -IFN, sementara kadar LH serum menurun dan kadar testosteron serum dan FSH meningkat secara signifikan. Baru-baru ini, Satie et al. [27] membandingkan galur tikus transgenik untuk IFN_(Tg10) dan galur saudara yang tidak memiliki subunit IFNAR1 dari IFNAR(Tg10-Ifnar1 _/_ ), kedua strain mengekspresikan transgen di testis. Tikus Tg10, tetapi bukan Tg10- mutan gandaIfnar1 _/_ , menunjukkan perubahan spermatogenesis. Perubahan histologis yang bergantung pada IFNAR yang paling penting adalah indeks apoptosis yang lebih tinggi di semua kategori sel germinal yang terjadi 3 minggu setelah permulaan produksi IFN, pada hari ke-20 pascakelahiran. Selain itu, Penulis menemukan bahwa beberapa gen terstimulasi interferon yang diketahui meningkat. diatur dalam sel Tg10 Sertoli dan sel germinal prepachytene. Pada hari ke 60, Tg10 jantan steril dan sel Sertoli menunjukkan peningkatan konsentrasi hormon anti-Mullerian dan penurunan produksi inhibin B. Berdasarkan temuan ini, mereka menyimpulkan bahwa pensinyalan interferon tipe I dapat terlibat dalam etiopatogenesis infertilitas idiopatik pria dengan mempengaruhi interaksi antara sel germinal dan sel Sertoli.

Perbedaan antara tanggal dan hub pesta bisa menjadi penting untuk merancang obat atau alat diagnostik dalam andrologi klinis [28].

Kelas node kedua yang memberikan kontrol kuat adalah kemacetan, terutama terlibat dalam kontrol aliran informasi dalam jaringan. Adapun hub, beberapa molekul yang diketahui terlibat dalam fisiologi sperma mewakili hambatan (lihat File tambahan 1 dan 2). Menariknya, jika dibandingkan dengan hub, dalam kemacetan ada protein yang kurang terwakili (masing-masing 28 vs. 59) dan reaksi yang lebih terwakili (masing-masing 81 vs. 9), sehingga menunjukkan relevansi kontrol yang lebih kuat pada aliran informasi (lihat di atas, hasil analisis tikus KO).

Untuk menilai keandalan data teoretis kami, kami mengevaluasi hasil analisis fenotipe reproduksi tikus KO. Dengan kata lain, kami membandingkan data mengenai hub dan kemacetan HSIN3.0_MC setelah penghapusan gen koresponden dan pengaruhnya terhadap kesuburan. Sangat menarik bahwa kami menemukan bahwa persentase frekuensi fenotipe kesuburan di hub dan di non-hub node tidak berbeda secara signifikan (P = 0,21991 (lihat Tabel 3), sedangkan penghapusan gen yang mengkodifikasi protein bottleneck pada 100% kasus menyebabkan infertilitas.

Temuan ini mengarahkan kami untuk menyimpulkan bahwa dalam jaringan kami, kemacetan memainkan peran yang lebih penting daripada hub. Alasan fungsi biologis yang berbeda ini dapat ditemukan di topologi spesifik jaringan. Memang HSIN3.0_MC dibentuk oleh tautan langsung (ini adalah gabungan dari beberapa jalur) sehingga dapat dianggap sebagai jaringan pengatur. Seperti yang ditunjukkan secara elegan oleh Yu et al. [29] dalam hal ini bottleneck lebih penting daripada hub, sedangkan dalam jaringan interaksi hub adalah pengontrol utama jaringan.

Jelas, percobaan ini memiliki keterbatasan penting karena sedikitnya hambatan, perbedaan spesifik spesies, dan ketidakmungkinan untuk menguji simpul non-protein. Bagaimanapun, menurut pendapat kami, temuan ini dapat memiliki implikasi penting karena menegaskan perbedaan fungsi antara jaringan regulasi dan interaksi dan, dari sudut pandang yang lebih umum, memungkinkan untuk mengeksplorasi fungsi biologis yang kompleks dengan menggunakan in silico ( jaringan)-in vivo (tikus KO) dengan mengontrol kompleksitasnya [30].

Setelah mengidentifikasi hub dan bottleneck di HSIN3.0_MC, menggunakan fungsi "intersection" dari Advanced Network Merge (dalam menu Cytoscape Tools), kami menghitung persimpangan jaringan sebagian besar hub dengan bottleneck, keduanya diperoleh dengan cytoHubba. Dengan cara ini, kami memperoleh jaringan (Jaringan Kontrol Interaktom Sperma Manusia, HSICN, lihat Gambar. 3) yang mewakili tulang punggung mekanisme kontrol yang terlibat dalam fisiologi spermatozoa. Analisisnya menyoroti gagasan bahwa beberapa node bertindak sebagai pengontrol seluruh jaringan, memungkinkan menyimpulkan dua implikasi biologis penting. Seperti yang pertama, kami menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk membuat peta mekanisme kontrol fungsi gamet jantan, dengan aplikasi potensial yang sangat besar dalam studi fisiologi dan patologi sperma. Kemudian, dalam beberapa kasus, pengontrol adalah molekul yang buruk atau tidak dipelajari sama sekali dalam spermatozoa. Ini, di satu sisi, dapat menjelaskan ketidakmampuan untuk melakukan diagnosis etiologis pada sejumlah besar pasien (infertilitas yang tidak dapat dijelaskan yang berasal dari pria) dan, di sisi lain, dapat menyarankan beberapa target baru untuk studi baru.

HSICN. Jaringan diwakili secara spasial menggunakan Cytoscape Prefuse Force Directed Layout. Program ini "didasarkan pada "paradigma" yang diarahkan oleh kekuatan. Node jaringan diperlakukan seperti objek fisik yang saling tolak-menolak, seperti elektron. Hubungan antar node diperlakukan seperti pegas logam yang melekat pada pasangan simpul. Pegas ini menolak atau menarik titik akhir mereka sesuai dengan fungsi fungsional yang berlaku. Algoritme tata letak menetapkan posisi node dengan cara yang meminimalkan jumlah gaya dalam jaringan "(Cytoscape 3.4.0 User Manual http://manual.cytoscape.org/ en/stable/index.html)). Diameter node berbanding lurus dengan derajat node dan gradien warna node tergantung dari koefisien clustering, dari merah (lebih tinggi) ke hijau (lebih rendah)

Masih melihat mekanisme yang aktif dalam memimpin fisiologi sperma, hasil analisis karakteristik protein yang dilakukan menggunakan Uniprot sangat menarik. Sebagai parameter pencarian, kami menggunakan faktor-faktor yang diketahui atau diduga terlibat dalam fisiologi dan biokimia sperma, dengan tujuan untuk menentukan simpul pengatur di dalam jaringan. Kami menemukan bahwa protein yang ada di HSIN3.0_MC diatur oleh pengikatan logam (12,3%), pengikatan kalsium (2,12%), pH (1,29%), dan suhu (0,32%) (lihat File tambahan 4, 5, 6 dan 7 ) (kami melaporkan persentase yang ditunjukkan oleh Uniprot, yang diremehkan).

Pengikatan logam dan pengikatan kalsium

Diketahui bahwa mesin biokimia spermatozoa berada di bawah kendali ion logam. Di sini kami menemukan bahwa Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , dan Fe 2+ adalah hub dari HSIN3.0_MC dengan 41, 37, 21, dan 14 tautan. Data ini sangat menarik mengingat adanya logam di saluran telur (baik dalam kondisi fisiologis atau sebagai respons terhadap sinyal neuro-endokrin), sebenarnya semuanya adalah kofaktor enzim, sehingga setuju dalam memodulasi seluruh mesin biokimia yang diekspresikan oleh spermatozoa. Sebagai contoh, diketahui bahwa konsentrasi Ca 2+ dalam cairan oviduktal mamalia segera sebelum ovulasi berada di bawah kendali hormonal, dan terlibat dalam modulasi homeostasis dan hiperaktivasi motilitas sperma [31], serta Ca 2+ adalah elemen kunci dalam kapasitasi sperma dan reaksi akrosom [13, 16]. Memang, spermatozoa diklasifikasikan sebagai sel yang dapat dirangsang, seperti neuron, yaitu sebagai sel yang fungsi biologisnya sangat bergantung pada kalsium.

Selain itu, seng telah dipelajari dalam berbagai eksperimen pada model mamalia dan non-mamalia yang berbeda. Dalam andrologi manusia telah ditemukan bahwa konsentrasi seng plasma mani secara negatif terkait dengan infertilitas pria [32] dan telah disarankan bahwa aktivitas yang menguntungkan dapat disebabkan oleh sifat antioksidannya [33,34,35]. Selain itu ion ini diketahui berinteraksi dengan beberapa enzim seperti akrosin, sehingga memodulasi fungsinya.

pH: adalah spermatozoa pH intraseluler merupakan pengontrol penting fungsi sel. Seperti yang baru-baru ini ditinjau, itu “sangat penting untuk fungsi spermatozoa. Khususnya, beberapa pengangkut ion sperma dan enzim unik yang eliminasinya menyebabkan infertilitas bergantung pada pHi atau entah bagaimana terkait dengan pHSaya regulasi” [36]. Secara khusus, molekul yang terlibat dalam pHSaya kontrol adalah CatSper, saluran Ca 2+ Slo, saluran K + penukar Na + /H + spesifik sperma dan adenilil siklase yang larut, dan aktif dalam fungsi sperma mendasar seperti motilitas, kapasitasi, dan reaksi akrosom.

Suhu

Spermatozoa selama perjalanan mereka di dalam saluran genital wanita mengalami perbedaan suhu lingkungan yang spesifik lokasi yang berasal dari gradien suhu. Sampai saat ini, data mengenai suhu di tuba fallopi manusia tidak tersedia sementara pada model mamalia (terutama pada kelinci dan babi) telah ditemukan bahwa tempat pembuahan di saluran telur adalah 1-2 °C lebih hangat daripada reservoir sperma [37] . Pada kelinci, telah ditunjukkan perbedaan suhu ini tergantung waktu dan meningkat dari 0,8 ± 0,2 °C sebelum ovulasi menjadi 1,6 ± 0,1 °C setelah ovulasi [38].

Mekanisme yang terlibat dalam fenomena ini belum sepenuhnya dipahami, tetapi tiga faktor penentu yang berbeda telah diusulkan:

Pelepasan makromolekul yang bergantung pada hormon, glikoprotein mukus asam, yang mengalami hidrasi endotermik ekstensif [39]

Pertukaran panas darah kontra-arus: darah dingin dari vena ovarium mendinginkan darah yang diarahkan ke saluran telur (seperti yang terjadi pada pleksus pampiniformis testis) [40]

Perubahan sumber suplai darah: arteri ovarium yang lebih hangat sebelum ovulasi dan arteri uterina yang lebih dingin setelah ovulasi [41].

Menariknya, hingga saat ini, jalur pensinyalan spesifik yang terlibat dalam termotaksis spermatozoa tidak diketahui, sementara telah dipahami bahwa pembuktian ini bergantung pada kapasitasi: hanya spermatozoa berkapasitas yang responsif secara termotaktik [37].


Fragmentasi DNA dalam sperma manusia setelah penyortiran sel yang diaktifkan secara magnetis

Karena pembuahan dengan spermatozoa apoptosis yang tidak dipilih dapat menyebabkan kegagalan dalam teknik reproduksi berbantuan, menjadi penting untuk menghilangkan jenis sperma ini untuk meningkatkan tingkat keberhasilan. Magnetic-activated cell sorting (MACS) merupakan teknik preparasi sperma yang mengisolasi spermatozoa non-apoptosis berdasarkan ekspresi phosphatidylserine pada membran spermatozoa yang mengalami apoptosis. Oleh karena itu, kami bertujuan untuk mengevaluasi apakah ada penurunan signifikan dalam fragmentasi DNA sperma (sDNAfrag) dan memverifikasi protokol mana yang paling efisien.

Metode

Seratus sampel semen dialokasikan ke dalam lima kelompok berbeda dan diproses menurut kombinasi MACS dengan teknik sentrifugasi gradien densitas (DGC) dan swim-up (SU).Fragmentasi DNA sperma dievaluasi dengan uji terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL).

Hasil

Grup DGC-SU (73,4%), DGC-MACS-SU (78,9%), DGC-SU-MACS (53,8%) dan MACS-SU (73,5%) menunjukkan penurunan sDNAfrag yang signifikan tetapi tingkat reduksi tertinggi diperoleh dengan MACS-DGC-SU (83,3%). Kemudian juga berkorelasi negatif dengan vitalitas sperma, integritas membran dan motilitas progresif. Selain itu, pasien teratozoospermia menunjukkan kecenderungan untuk memiliki tingkat reduksi sDNAfrag yang lebih rendah daripada pasien astenozoospermia dan asthenoteratozoospermia.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil, MACS menunjukkan potensi untuk mengoptimalkan laju reduksi sDNAfrag, bila diterapkan pada semen mentah, sebelum DGC dan SU, terutama pada sampel dengan nilai motilitas progresif, vitalitas, dan uji pembengkakan hipoosmotik yang rendah.


Diskusi

Kami menemukan sebelumnya bahwa sperma haploinsufisien untuk PRM1 atau PRM2 gagal menghasilkan keturunan. DNA dilepaskan dari inti sperma yang kekurangan PRM1 atau PRM2 dalam buffer lisis SDS tanpa adanya zat pereduksi, sedangkan pembelahan ikatan disulfida diperlukan untuk melepaskan DNA dari inti sperma tipe liar [2]. Dipercaya bahwa protamin menstabilkan kromatin sperma dengan perakitannya di alur kecil DNA menjadi susunan padat yang dihubungkan oleh ikatan disulfida antarmolekul dan intramolekul. Selain itu, 1) defisiensi protamin berhubungan dengan infertilitas pada pria [ 5, 6, 12], 2) frekuensi kerusakan DNA sperma manusia berhubungan dengan kegagalan perkembangan embrio setelah ICSI [ 7], 3) kerusakan DNA sperma yang diinduksi oleh pajanan ayah terhadap siklofosfamid mengakibatkan lebih dari 80% kehilangan keturunan peri-implantasi pada tikus [ 13 ], dan 4) persentase blastokista yang berkembang dari sperma tikus yang terpapar pada peningkatan jumlah radiasi gamma menurun seiring dengan meningkatnya tingkat kerusakan DNA [ 14]. Pengamatan ini membuat kami berhipotesis bahwa kegagalan chimera untuk mentransmisikan genotipe 129 ke keturunannya adalah karena haploinsufisiensi protamin mengakibatkan perubahan dalam organisasi dan integritas DNA sperma. Temuan dalam penelitian ini mendukung hipotesis ini.

Pengamatan pada tingkat mikroskop cahaya menunjukkan bahwa beberapa sperma yang kekurangan protamin memiliki bentuk kepala yang tidak normal [2]. Dengan menggunakan pemindaian mikroskop elektron, kami menemukan frekuensi sperma dengan kepala kecil atau berbentuk tidak normal yang tertutup secara longgar oleh membran plasma yang berkorelasi dengan persentase sperma yang kekurangan PRM2. Mikroskop elektron transmisi mengungkapkan bahwa kromatin pada sperma yang kekurangan PRM2 kurang kompak dibandingkan kromatin pada sperma dari tikus tipe liar dan mirip dengan kromatin yang memadat pada spermatid yang memanjang. Perbedaan ini mungkin karena perubahan struktural yang dihasilkan dari penurunan tingkat PRM2, karena gugus arginin bermuatan positif pada protamin diyakini dapat menetralkan gugus fosfat bermuatan negatif pada DNA [15, 16]. Oleh karena itu, pengurangan jumlah protamin akan mengubah tidak hanya stoikiometri komponen utama kromatin tetapi juga muatan bersih dalam inti sperma, sehingga mempengaruhi kondensasi dan stabilitas kromatin.

Dipertimbangkan bersama dengan penelitian lain, hasil kami memberikan wawasan tentang hubungan antara defisiensi PRM2 dan kegagalan perkembangan setelah ICSI. Sampai saat ini, persyaratan minimal untuk genom ayah fungsional untuk berpartisipasi dalam embriogenesis adalah inti sperma dengan matriks inti struktural utuh. Inti sperma dilucuti dari komponen sitoplasma dan digunakan untuk ICSI menghasilkan embrio yang dikembangkan untuk keturunan hidup [17]. Namun, pengobatan dengan protease atau agen pereduksi ikatan disulfida sebelum ICSI mengakibatkan kegagalan perkembangan [18]. Kami telah menemukan sebelumnya bahwa sperma yang kekurangan PRM2 tidak bergerak [2]. Gangguan motilitas sperma bisa disebabkan oleh hilangnya viabilitas sperma, yang menyebabkan kerusakan kromatin. Dalam penelitian ini, sperma sedikit disonikasi untuk memisahkan kepala dan ekor sebelum ICSI. Ada kemungkinan bahwa sonikasi menyebabkan kerusakan tambahan pada integritas kromatin yang berubah dari sperma yang kekurangan PRM2. Dengan demikian, kegagalan perkembangan beberapa telur yang disuntik dengan sperma yang kekurangan PRM2 mungkin merupakan efek tidak langsung karena kerusakan yang ada pada sperma mati dan/atau diinduksi oleh sonikasi. Meskipun demikian, bentuk nukleus yang menyimpang dan kepadatan kromatin yang berkurang dari sperma yang kekurangan PRM2 sangat menunjukkan bahwa integritas struktural nukleus ini telah dikompromikan, yang menyebabkan kegagalan perkembangan embrio.

Pemrosesan PRM2 yang tidak lengkap terlihat pada sperma tikus dengan mutasi heterozigot pada Prm1 dan Prm2 [ 2] dan sering terlihat di mana ada perubahan tingkat PRM1 atau PRM2 atau komponen nuklir lainnya. Ini diamati pada sperma tikus dengan mutasi nol pada Tp1 [ 19], Tp2 [ 20], dan Camk4 [ 21, 22] dengan penekanan Prm1 terjemahan pada tikus transgenik gain-of-fungsi MSY4 [23] dengan terjemahan prematur PRM1 pada tikus transgenik [24] dan sperma pria infertil [6, 25]. Meskipun infertilitas terjadi pada beberapa penelitian ini [23, 24], hal itu tidak terlihat pada penelitian lain [19-21], menunjukkan bahwa pemrosesan PRM-2 yang tidak lengkap bukanlah penyebab utama kegagalan perkembangan yang terjadi setelah ICSI dengan defisiensi PRM2. sperma.

Cacat pada kondensasi kromatin sperma terlihat pada tikus dengan mutasi heterozigot pada Prm1 dan Prm2 [ 2] juga terjadi ketika protamine unggas yang mengekspresikan transgen diekspresikan dalam spermatid [26] dalam mutasi nol dari Tp1 [ 19], Tp2 [ 20], dan Csnk2a2 [ 27] dengan penekanan Prm1 terjemahan di MSY4 gain-of-fungsi tikus transgenik [23] dan sperma dari beberapa pria tidak subur [28]. Karena infertilitas terlihat hanya pada beberapa penelitian yang mengamati kondensasi DNA yang tidak lengkap [2, 23], kondensasi kromatin yang rusak saja mungkin tidak cukup untuk mencegah partisipasi genom pria dalam perkembangan. Namun, cacat yang lebih parah pada kondensasi kromatin yang mencakup gangguan matriks inti mungkin memiliki efek pada integritas DNA.

PRM2 merupakan dari 0% hingga hampir 80% dari total protamin dalam sperma dari spesies mamalia yang berbeda, menunjukkan bahwa PRM1, PRM2, dan DNA berinteraksi untuk membentuk kompleks pada spesies yang berbeda dengan stoikiometri yang jauh berbeda [1]. Meskipun DNA sperma mamalia dikemas dalam subunit toroidal yang secara substansial lebih besar dari nukleosom [29], protamin tidak berinteraksi satu sama lain secara konsisten, dan ikatannya dengan DNA tidak bergantung pada urutan [1]. Namun, untuk spesies tertentu, perakitan protamin dan DNA menjadi kompleks cenderung memiliki stoikiometri yang tepat. Meskipun spermatid pada tikus dapat mengkompensasi overekspresi PRM1 [30] dan ekspresi protamine unggas tingkat tinggi [26], mereka gagal untuk mengkompensasi pengurangan jumlah PRM1 atau PRM2 [2, 21, 23]. Ini menunjukkan bahwa titik setel untuk ekspresi PRM1 dan PRM2 mendekati minimum yang diperlukan untuk pembentukan kompleks dan perlindungan DNA.

Sperma yang kekurangan PRM2 memiliki jumlah PRM1 yang berkurang, menunjukkan bahwa PRM1 membutuhkan jumlah PRM2 yang normal untuk dimasukkan ke dalam kromatin sperma. Meskipun mekanisme yang bertanggung jawab atas kerusakan DNA pada sperma yang kekurangan PRM1/PRM2 masih harus ditentukan, kami percaya skenario yang mungkin adalah bahwa haploinsufisiensi PRM2 mengganggu stoikiometri pembentukan kompleks oleh komponen utama kromatin. Hal ini menghasilkan kondensasi kromatin yang tidak sempurna, yang membahayakan integritas struktural dari matriks inti. Kondisi ini diperparah dengan penurunan pembentukan ikatan disulfida akibat berkurangnya jumlah PRM1 dan PRM2. Sebagai akibat dari perubahan ini, DNA sangat rentan terhadap kerusakan pada saluran reproduksi oleh kondisi yang dapat ditoleransi oleh sperma dengan komponen inti lengkap tetapi tidak oleh sperma yang kekurangan PRM1/PRM2.

Singkatnya, kami menemukan bahwa 1) persentase sperma dengan DNA yang rusak terlihat dengan uji komet, 2) frekuensi sperma dengan bentuk kepala yang tidak normal dilihat dengan mikroskop elektron, 3) dan persentase telur tikus metafase II yang gagal ditangkap. untuk berkembang ke tahap blastokista setelah ICSI sebanding dengan persentase sperma yang kekurangan PRM2 dalam sampel yang dianalisis. Meskipun hasil serupa telah terlihat secara individual dalam penelitian lain, kami percaya ini adalah penelitian pertama yang menggunakan model hewan untuk menunjukkan bahwa mereka terjadi bersama-sama. Temuan ini sangat menyarankan bahwa pengurangan moderat kadar protamin dalam sperma menghasilkan kerusakan DNA yang tidak sesuai dengan transmisi genom pria ke generasi berikutnya.


Peneliti menggunakan drone untuk menimbang paus

Dengan mengukur panjang tubuh, lebar, dan tinggi paus kanan selatan yang hidup bebas yang difoto oleh drone, para peneliti dapat mengembangkan model yang secara akurat menghitung volume tubuh dan massa paus.

Karena ukurannya yang besar dan kehidupan airnya, sebelumnya satu-satunya cara untuk mendapatkan data massa tubuh paus adalah dengan menimbang individu yang mati atau terdampar.

Metode inovatif dapat digunakan untuk mempelajari lebih lanjut tentang fisiologi dan ekologi paus, "Mengetahui massa tubuh paus yang hidup bebas membuka jalan penelitian baru. Kami sekarang akan dapat melihat pertumbuhan individu tua yang diketahui untuk menghitung massa tubuh mereka meningkat dari waktu ke waktu dan kebutuhan energi untuk pertumbuhan. Kami juga akan dapat melihat kebutuhan energi harian paus dan menghitung berapa banyak mangsa yang perlu mereka konsumsi." kata Asisten Profesor Fredrik Christiansen dari Aarhus Institute of Advanced Studies di Denmark dan penulis utama studi tersebut.

Michael Moore, Ilmuwan Senior di Lembaga Oseanografi Woods Hole dan rekan penulis mengatakan: "Pengukuran berat paus hidup di laut menginformasikan bagaimana stres kronis memengaruhi kelangsungan hidup dan kesuburan mereka, serta memungkinkan pemberian dosis obat penenang yang akurat untuk hewan yang terjerat dalam penangkapan ikan. peralatan yang tidak menyukai upaya penguraian."

Model ini sudah digunakan untuk menilai dampak pelecehan camar rumput laut terhadap kesehatan dan kelangsungan hidup anak paus selatan. Dr. Mariano Sironi dan Dr. Marcela Uhart dari Southern Right Whale Health Monitoring Program dan rekan penulis, menekankan "Penggunaan drone untuk memperkirakan berat dan kondisi paus, serta untuk melacak anak-anak paus secara individual saat mereka tumbuh di samping induknya, telah menjadi terobosan nyata dalam penyelidikan kami."

"Di masa lalu kami harus bergantung sepenuhnya pada bangkai yang terdampar yang menambahkan segala macam ketidakpastian pada penelitian kami."

Model ini juga memungkinkan para peneliti untuk berkolaborasi dengan Digital Life Project di University of Massachusetts, AS untuk membuat ulang jaring 3D paus terlebih dahulu, dan kemudian bekerja dengan seniman CG Robert Gutierrez untuk membuat ulang model 3D penuh warna dari kanan. Paus. Model-model ini dapat digunakan baik untuk tujuan ilmiah, seperti mempelajari gerakan, maupun untuk tujuan pendidikan.

Dengan menyesuaikan parameter model, pendekatan ini dapat digunakan untuk memperkirakan ukuran mamalia laut lainnya di mana metode alternatif yang lebih invasif tidak layak atau tidak diinginkan.

Paus baleen, yang termasuk spesies seperti paus biru, adalah hewan terbesar di planet ini, dengan massa tubuh menjadi pusat kesuksesan mereka sebagai kelompok hewan. Namun, data tentang ukuran mereka secara historis terbatas pada spesimen mati, dengan sebagian besar sampel berasal dari operasi penangkapan ikan paus, tangkapan sampingan perikanan yang tidak disengaja atau terdampar di pantai.

Pengumpulan data tentang paus mati memiliki keterbatasan seperti tidak dapat mengumpulkan data longitudinal selama rentang hidup paus dan ketidakakuratan dari distorsi fisik bangkai yang disebabkan oleh kembung dan deflasi.

Asisten Profesor Christiansen menjelaskan bahwa "Kesulitan dalam mengukur massa tubuh secara andal pada paus yang hidup bebas, telah mencegah dimasukkannya massa tubuh dalam banyak penelitian di bidang ekologi, fisiologi, dan bioenergi. Pendekatan baru ini sekarang akan memungkinkan untuk akhirnya memasukkan variabel sentral ini. ke dalam studi masa depan tentang paus yang hidup bebas."

Untuk menghitung volume tubuh dan massa paus kanan selatan, para peneliti pertama-tama mengambil foto udara dari 86 individu di lepas pantai Península Valdés, Argentina. Perairan yang jernih dan sejumlah besar paus yang berkumpul di sana setiap musim dingin untuk berkembang biak menjadikannya tempat yang ideal untuk mengumpulkan gambar berkualitas tinggi dari sisi punggung dan samping paus. Dari ini mereka dapat memperoleh pengukuran panjang, lebar dan tinggi.

Pengukuran ini kemudian dapat digunakan untuk memodelkan bentuk tubuh dan volume paus secara akurat. "Kami menggunakan model ini untuk memperkirakan volume tubuh paus yang ditangkap dalam operasi penangkapan ikan paus ilmiah, yang ketebalan dan massa tubuhnya diketahui. Dari perkiraan volume tubuh ini, kami kemudian dapat menghitung kepadatan paus, yang pada gilirannya dapat kami gunakan. untuk memperkirakan massa paus yang hidup bebas yang difoto oleh drone kami." Kata Christiansen.

Meskipun model menghasilkan perkiraan massa tubuh dengan tingkat akurasi yang tinggi, ada beberapa keterbatasan karena proporsi relatif dari jaringan yang berbeda pada paus balin. Christiansen berkata, "Kami harus mengasumsikan kepadatan tubuh paus yang konstan, yang tidak realistis karena proporsi jaringan tubuh yang berbeda (lemak, otot, dll.) berubah secara musiman saat paus menyimpan atau kehilangan kondisi tubuh."


Hasil

Semua sampel semen adalah normozoospermia (konsentrasi > 15 x 10 6 sperma/mL, motilitas progresif > 32%, vitalitas > 58%, dan bentuk normal > 4%) pada evaluasi pertama (setelah 3-4 hari pantang).

Seperti yang diharapkan, volume mani berkurang selama periode DE. Demikian pula, jumlah spermatozoa per ejakulasi juga berkurang bila dibandingkan dengan evaluasi awal (p & lt0,05). Pengamatan ini sudah terlihat pada Hari 2. Menariknya, konsentrasi sperma, motilitas, motilitas progresif dan morfologi tidak berbeda secara signifikan dari evaluasi pertama selama periode DE seperti yang dapat dilihat pada Tabel 1. Namun, variasi intra-individu yang luas diamati pada masing-masing parameter tersebut. Perubahan halus dalam motilitas dan viabilitas sperma patut dicatat, dengan jumlah spermatozoa yang layak sebenarnya meningkat pada hari ke-13 percobaan dibandingkan dengan evaluasi awal (69,8 ± 5,6% vs 60,2 ± 3,1%, p < 0,05). Semua parameter dasar ini selanjutnya tetap berada di atas nilai referensi WHO 2010 sepanjang periode DE kecuali untuk viabilitas pada hari ke 4 (53,7 ± 7,4%), yang menurun hingga di bawah nilai referensi 58% (lihat Tabel 1).

Tak satu pun dari parameter fungsional dipengaruhi secara signifikan oleh dua minggu DE. Integritas membran plasma sperma (di atas 50% sel yang hidup) dan MMP tetap stabil selama periode tersebut. Persentase fragmentasi DNA tidak berbeda nyata dari pengukuran awal. DFI tetap dalam tingkat yang dapat diterima (<29%). Berkenaan dengan produksi ROS intraseluler, tren pengurangan diamati dari waktu ke waktu (secara statistik tidak signifikan). Variasi intra dan antar individu dari parameter mani konvensional dan fungsional selama periode DE digambarkan pada Gambar. 1 dan 2.

Variasi intra dan antar individu dari parameter sperma konvensional. Distribusi parameter konvensional (volume semen, konsentrasi sperma, motilitas dan viabilitas) selama periode evaluasi frekuensi ejakulasi harian. n = 6 individu (A-F) untuk setiap parameter

Variasi intra dan antar individu dari parameter sperma fungsional. Distribusi parameter fungsional (indeks fragmentasi DNA, potensi membran mitokondria, integritas membran plasma, spesies oksigen reaktif) selama periode ejakulasi harian. n = 6 individu (A-F) untuk setiap parameter (DFI: Indeks Fragmentasi DNA, MMP: Potensi Membran Mitokondria, persen integritas membran, dan produksi ROS intraseluler: Spesies Oksigen Reaktif)


Kriopreservasi Sperma Manusia: Pembaruan Teknik, Efek pada Integritas DNA, dan Implikasinya terhadap ART

Kriopreservasi spermatozoa manusia—diperkenalkan pada tahun 1960-an—telah diakui sebagai prosedur yang efisien untuk manajemen kesuburan pria sebelum terapi penyakit ganas, vasektomi atau perawatan infertilitas bedah, untuk menyimpan spermatozoa donor dan pasangan sebelum perawatan reproduksi berbantuan dan untuk memastikan pemulihan sejumlah kecil spermatozoa pada infertilitas faktor pria yang parah. Terlepas dari kegunaannya, kriopreservasi dapat menyebabkan perubahan yang merusak struktur dan fungsi sperma: sementara efek kriopreservasi pada sel didokumentasikan dengan baik, sampai saat ini tidak ada kesepakatan dalam literatur tentang apakah kriopreservasi mempengaruhi integritas kromatin sperma atau tidak. penggunaan protokol yang unik dan fungsional untuk prosedur pembekuan-pencairan. Oleh karena itu, kriopreservasi sperma merupakan komponen penting dari manajemen kesuburan dan sebagian besar penerapannya yang berhasil tampaknya memengaruhi hasil reproduksi teknologi reproduksi berbantuan (ART): penggunaan krioprotektan yang tepat sebelum dan teknologi pemilihan sperma setelah kriopreservasi tampaknya memiliki dampak terbesar dalam mencegah Fragmentasi DNA, sehingga meningkatkan tingkat cryosurvival sperma.

1. Perkenalan

Prosedur yang memungkinkan untuk menstabilkan sel pada suhu kriogenik disebut kriopreservasi, juga dikenal sebagai aspek terapan kriobiologi atau studi tentang kehidupan pada suhu rendah. Banyak kemajuan dalam teknologi kriopreservasi telah mengarah pada pengembangan metode yang memungkinkan pemeliharaan suhu rendah dari berbagai jenis sel termasuk gamet jantan dan betina, organisme multiseluler kecil, dan bahkan organisme yang lebih kompleks seperti embrio. Kriopreservasi spermatozoa manusia—diperkenalkan pada tahun 1960-an [1]—telah mengatasi banyak keterbatasan ruang dan waktu dan sekarang menjadi bagian integral dari teknologi reproduksi berbantu (ART).

Teknik ini menjadi sangat penting dalam kasus pelestarian kesuburan pria sebelum radioterapi atau kemoterapi [2] yang dapat menyebabkan kegagalan testis atau disfungsi ejakulasi. Faktanya, penyimpanan air mani tampaknya menjadi satu-satunya metode terbukti yang dapat menawarkan pasangan ini kesempatan untuk memiliki anak di masa depan: terapi kanker sebenarnya dapat menyebabkan kerusakan, mengakibatkan subfertilitas atau kemandulan karena pengangkatan gonad atau kerusakan permanen pada sel germinal. disebabkan oleh terapi adjuvan. Secara khusus, risiko yang terkait dengan terapi tergantung pada beberapa faktor: usia pasien pada saat pengobatan, dosis, lokasi, dan jenis pengobatan [3]. Juga beberapa penyakit tidak ganas, seperti diabetes dan gangguan autoimun, dapat menyebabkan kerusakan testis. Cryopreservation disarankan juga dalam kondisi ini [4]. Di negara-negara di mana fertilisasi heterolog diizinkan oleh hukum dan dalam program inseminasi donor, kriopreservasi perlu memiliki waktu yang cukup untuk menyaring donor untuk agen infeksi, seperti virus human immunodeficiency (HIV) dan hepatitis B, sebelum semen kriopreservasi digunakan untuk uji klinis. tujuan [5]. Pada pasien azoospermia, yang telah menjalani ekstraksi sperma testis atau aspirasi sperma epididimis perkutan, penyimpanan sperma juga digunakan untuk menghindari biopsi atau aspirasi berulang [6]. Lebih lanjut, kriopreservasi secara rutin dilakukan pada pasien yang—harus memulai pengobatan reproduksi berbantuan—memutuskan untuk membekukan sampel air mani terlebih dahulu untuk menghindari ketidaknyamanan akibat ejakulasi yang gagal yang sering dikaitkan dengan “stres pengumpulan air mani,” keadaan emosional tertentu, atau komitmen lain di waktu pengambilan oosit [7]. Akhirnya, pembekuan gamet jantan sebagian besar direkomendasikan untuk mempertahankan kesuburan pada subjek yang—karena satu dan lain alasan—terpapar agen yang berpotensi toksik yang dapat mengganggu gametogenesis [7].

2.Teknik untuk Kriopreservasi

Ada dua teknik pembekuan konvensional utama yang digunakan dalam kriopreservasi sperma: pembekuan lambat dan pembekuan cepat

2.1. Pembekuan Lambat

Teknik pembekuan lambat yang diusulkan oleh Behrman dan Sawada [8] terdiri dari pendinginan sperma progresif selama 2-4 jam dalam dua atau tiga langkah, baik secara manual atau otomatis menggunakan freezer semiprogrammable.

Cara manual dilakukan dengan menurunkan suhu semen secara bersamaan sambil menambahkan krioprotektan secara bertahap dan setelah sampel dicelupkan ke dalam nitrogen cair [9]. Telah ditunjukkan bahwa laju pendinginan awal yang optimal dari spesimen dari suhu kamar hingga 5°C adalah 0,5-1°C/menit [10]. Sampel kemudian dibekukan dari 5°C hingga -80 °C dengan laju 1–10 °C/menit. Spesimen kemudian dicelupkan ke dalam nitrogen cair pada suhu -196°C [11].

Terlepas dari laporan yang menunjukkan keberhasilan pembekuan sperma dengan teknik manual, reproduktifitas prosedur ini dapat menimbulkan beberapa masalah. Untuk alasan ini, freezer yang dapat diprogram telah diselidiki [12]. Freezer menggunakan piring untuk menahan sedotan. Ini didinginkan oleh nitrogen cair yang disimpan di tangki penyimpanan di bawah piring. Nitrogen cair dituangkan ke dalam tangki, dan mesin, setelah diprogram, menggunakan pencatatan data perangkat lunak untuk memperoleh pendinginan dari 20°C hingga 80°C dengan laju 1,5°C/menit dan kemudian pada 6°C/menit setelah selesai dari pembekuan sedotan dikeluarkan dan disimpan ke dalam nitrogen cair pada -196°C. Ini memakan waktu sekitar 40 menit [12]. Program mudah digunakan dan memungkinkan kombinasi pendinginan yang tidak memerlukan intervensi operator terus menerus dan telah digunakan untuk meningkatkan reproduktifitas operasi pembekuan [12].

Beberapa penulis berpendapat bahwa pembekuan lambat konvensional, baik panduan atau otomatis, menyebabkan kerusakan kimia-fisik yang luas pada sperma mungkin karena kristalisasi es [13].

2.2. Pembekuan Cepat

Pembekuan cepat pertama kali diusulkan oleh Sherman [14]. Teknik ini membutuhkan kontak langsung antara sedotan dan uap nitrogen selama 8-10 menit dan perendaman dalam nitrogen cair pada -196°C. Di dalam uap nitrogen ada gradien termal, sebagai fungsi dari jarak dan volume cairan di bawahnya. Sampel awalnya dicampur secara tetes demi tetes dengan volume yang sama dari krioprotektan dingin, campuran tersebut dimasukkan ke dalam sedotan dan dibiarkan diinkubasi pada suhu 4°C selama 10 menit. Sedotan kemudian ditempatkan pada jarak 15-20 cm di atas tingkat nitrogen cair (−80°C) selama 15 menit setelah tahap ini, sedotan direndam dalam nitrogen cair. Selama pendinginan, lebih baik menempatkan sedotan dalam posisi horizontal untuk meminimalkan perbedaan panas antara kedua ujungnya. Teknik ini memiliki beberapa kelemahan di antaranya, reproduktifitas rendah, memang kurva penurunan suhu tidak dapat dikontrol, dan suhu beku dapat bervariasi dari 70, 80, dan 99°C [7].

2.3. Kriopreservasi Sejumlah Kecil Spermatozoa

Metode konvensional kriopreservasi sperma yang dijelaskan di atas tidak ideal untuk kriopreservasi sejumlah kecil sel, seperti spermatozoa epididimis dan testis. Kriopreservasi yang efisien dari spermatozoa yang diambil melalui pembedahan, seperti yang disebutkan sebelumnya dalam bab ini, mengurangi jumlah intervensi bedah dan menghindari masalah logistik yang terkait dengan koordinasi pengambilan oosit wanita dan juga risiko tidak ditemukannya sperma pada hari pengambilan oosit [15] . Dengan demikian, pendekatan kriopreservasi baru telah dirancang untuk kriopreservasi sperma motil dalam jumlah terbatas dalam volume yang sangat kecil.Tabel 1). Baik pembawa biologis dan nonbiologis telah dicoba untuk kriopreservasi sejumlah kecil spermatozoa, meskipun, sampai saat ini, tidak ada percobaan acak prospektif yang telah dilakukan untuk menunjukkan bahwa pembawa tunggal mana pun lebih unggul dari yang lain [15]. Selain itu, hingga saat ini penggunaan teknologi ini terbatas di sebagian besar program IVF. Hal ini menunjukkan bahwa teknologi cryopreservation baru, yang dirancang untuk menangani jumlah sperma yang kecil dan perlu dieksplorasi lebih lanjut [15]. Apapun metode yang digunakan, untuk mendapatkan hasil yang baik, penting untuk melakukan semua langkah dengan benar sebelum dan sesudah kriopreservasi: pilihan krioprotektan yang lebih cocok dan prosedur pencairan sangat penting.

2.4. Krioprotektan

Krioprotektan adalah bahan kimia dengan berat molekul rendah dan sangat permeabel yang digunakan untuk melindungi spermatozoa dari kerusakan beku akibat kristalisasi es. Ada empat krioprotektan utama yang terkenal: gliserol, etilena glikol, dimetil sulfoksida, dan 1,2-propanediol. Krioprotektan bekerja dengan menurunkan titik beku suatu zat, mengurangi jumlah garam dan zat terlarut yang ada dalam fase cair sampel dan dengan mengurangi pembentukan es di dalam spermatozoa [16]. Biasanya krioprotektan ditambahkan ke dalam semen dengan volume yang sama secara tetes demi tetes, dicampur perlahan pada suhu kamar, dan kemudian ditempatkan pada suhu 37°C selama 10-15 menit untuk memungkinkan keseimbangan yang tepat antara sel dan medium [7]. Media harus berinteraksi dengan sel. Memang efektifitas zat krioprotektan juga merupakan fungsi dari waktu interaksi antara krioprotektan dengan sel [7]. Gliserol adalah krioprotektan permeasi yang paling banyak digunakan untuk sperma manusia yang bekerja pada: struktur membran, permeabilitas dan stabilitas lapisan ganda lipid, asosiasi protein permukaan dan metabolisme seluler. Penggunaannya memberikan hasil yang tidak menguntungkan pada membran dan struktur akrosom, meskipun memungkinkan pembekuan sperma berkualitas buruk [7]. Studi Sherman [14] menunjukkan bahwa penggunaan gliserol dapat menyebabkan beberapa perubahan seperti: adanya membran bergelombang, perubahan membran internal akrosom, inhomogenitas nukleus dan disorganisasi di puncak mitokondria. Setelah pengamatan ini, zat pelindung lainnya diusulkan seperti dimetil sulfoksida (DMSO), yang memiliki efek merusak pada sperma manusia bila digunakan pada suhu 4°C, dan 1,2-propanediol sedikit digunakan dalam kriopreservasi sperma [7].

2.5. Prosedur Pencairan

Prosedur pencairan adalah langkah yang sama pentingnya: sel harus diizinkan untuk memulihkan aktivitas biologis normalnya dengan mencoba menghindari perubahan termal yang tiba-tiba sejauh mungkin. Secara umum, protokol kriopreservasi menggunakan suhu pencairan 37°C bahkan jika suhu pencairan yang lebih tinggi memungkinkan pemanasan yang lebih cepat, mereka tidak digunakan karena risiko yang terkait dengan kerusakan sel.

Saat ini, beberapa teknik pencairan digunakan, di antaranya adalah (i) pencairan pada suhu kamar selama 10 menit dan selanjutnya termostat lulus pada 37 ° C selama 10 menit, (ii) pencairan dalam termostat dan penangas air pada suhu 37 °C selama 10 menit, (iii) pencairan pada suhu kamar selama 15 menit.

Setelah semen dicairkan, dipisahkan dari media kriopreservasi dengan cara dicuci dalam media kultur dan disentrifugasi [7].

3. Efek Merugikan dari Cryopreservation pada Integritas Sperma

Dibandingkan dengan jenis sel lain, spermatozoa tampaknya kurang sensitif terhadap kerusakan kriopreservasi karena fluiditas membran yang tinggi dan kadar air yang rendah (sekitar 50%). Meskipun demikian, kriopreservasi dapat menyebabkan perubahan merusak struktur dan fungsi sperma [17]. Sebagian besar dilaporkan bahwa beberapa proses yang merusak dapat terjadi selama pembekuan-pencairan spermatozoa manusia, seperti kejutan termal dengan pembentukan kristal es intraseluler dan ekstraseluler, dehidrasi seluler, dan syok osmotik [18].

Penyebab utama kerusakan sel selama kriopreservasi adalah pembentukan kristal es intraseluler atau ekstraseluler. Selama proses pembekuan, laju pendinginan memainkan peran penting dalam menentukan sejauh mana cryoinjury pada spermatozoa [9].

Laju pendinginan yang cepat menyebabkan pembentukan es intraseluler yang parah, karena aliran air melintasi membran terganggu, sehingga menyebabkan pendinginan super.

Kristal es yang terbentuk menembus membran dan mempengaruhi fungsi organel. Kondisi ini menyebabkan kelangsungan hidup sel terganggu. Di sisi lain, laju pendinginan yang terlalu lambat menentukan aliran air dari lingkungan internal ke lingkungan eksternal, meningkatkan konsentrasi zat terlarut dan tekanan osmotik. Kondisi ini menyebabkan perubahan volume sel yang terkait dengan pergerakan air, dehidrasi, dan kerusakan toksisitas akibat konsentrasi zat terlarut yang tinggi [9]. Cryoinjury tidak terbatas pada proses pembekuan tetapi juga dapat terjadi selama proses pencairan saat es mencair atau rekristalisasi [9]. Fenomena rekristalisasi es baik intraseluler maupun ekstraseluler, pada sampel beku, terjadi sebagai kristal es yang lebih kecil dengan laju rekristalisasi yang meningkat dengan meningkatnya suhu [13].

Sebagian besar telah dilaporkan bahwa cedera dingin dapat memodifikasi struktur dan integritas membran plasma [19, 20] terutama terdiri dari fosfolipid dan kolesterol [21].

Meskipun konsentrasi tinggi kolesterol dan asam lemak tak jenuh ganda memberikan fluiditas lebih pada membran pada suhu yang lebih rendah [22], selama kriopreservasi proses pendinginan menyebabkan transisi fase lipid membran dan merusak fungsi protein membran. Secara khusus, lapisan luar membran plasma spermatozoa terdiri dari glikokaliks, zona kaya karbohidrat yang terutama mengandung rantai oligosakarida yang mengikat protein integral membran plasma (glikoprotein) atau lipid (glikolipid). Umumnya, kriopreservasi mungkin memiliki efek merugikan mengubah komposisi karbohidrat glikokaliks, sehingga mengganggu fungsi protein membran yang bertanggung jawab untuk transportasi ion dan metabolisme dan mempengaruhi kemampuan pemupukan [24]: glikokaliks terlibat dalam beberapa fungsi fisiologis seperti perlindungan kekebalan dari saluran genital wanita [25], reaksi akrosom [26], dan interaksi gamet awal.

Membran plasma dan mitokondria memiliki kerentanan yang sama terhadap kriopreservasi [27]. Mitokondria ditempatkan di sepanjang bagian tengah antara membran plasma dan sembilan kolom fibrosa, untuk membentuk lapisan yang menyediakan energi yang diperlukan untuk motilitas sperma [27]. Jumlah energi terbesar disediakan oleh molekul ATP yang disintesis baik oleh glikolisis di sitoplasma [28] atau melalui fosforilasi oksidatif (oxphos) di mitokondria [10].

ATP yang dihasilkan oleh oxphos di membran mitokondria bagian dalam ditransfer ke mikrotubulus, untuk mendorong motilitas [29]. Oleh karena itu, penurunan aktivitas mitokondria dapat menjelaskan penurunan motilitas [27].

Perubahan fluiditas membran mitokondria juga dapat menyebabkan perubahan potensial membran mitokondria dan pelepasan ROS [9]. Kerusakan peroksidatif yang disebabkan oleh peningkatan konsentrasi ROS dikaitkan dengan kerusakan membran plasma sperma dan kerusakan struktur aksonema [30]. Selain itu, kriopreservasi telah terbukti mengurangi aktivitas antioksidan spermatozoa yang membuatnya lebih rentan terhadap kerusakan ROS [31]. Konsentrasi tinggi ROS dan penurunan enzim antioksidan menyebabkan apoptosis sel [32]. Dalam konteks ini kaskade apoptosis dimediasi oleh aktivasi protein keluarga BCL2: ada permeabilisasi membran mitokondria luar melalui protein Bax dan BAK dan pelepasan sitokrom [33]. Pada gilirannya, caspase 9 diaktifkan bersama dengan APAF-1 untuk membentuk apoptosom [34]. Pelepasan faktor apoptosis-inducing dari mitokondria menyebabkan fragmentasi DNA [35]. Beberapa studi meneliti peran in vitro suplementasi antioksidan dalam melindungi DNA sperma dari kerusakan oksidatif. Misalnya, ketika ditambahkan ke cairan mani selama kriopreservasi, genistein [36], resveratrol [37], dan asam askorbat [37] tampaknya mengurangi kerusakan DNA sebaliknya, vitamin E [38], askorbat, dan katalase [39] tampaknya meningkatkan motilitas dan mengurangi kadar ROS, meskipun mereka tidak meningkatkan viabilitas spermatozoa dan tidak mengurangi kerusakan DNA. Bagaimanapun, jumlah penelitian ini dan jumlah pasien yang mereka sertakan masih terlalu terbatas untuk menarik kesimpulan tentang kemanjuran suplementasi antioksidan dalam melindungi DNA dari kerusakan akibat pembekuan.

3.1. Kriopreservasi dan Kerusakan DNA

Sementara efek kriopreservasi pada kapasitas fertilisasi, motilitas, morfologi, dan viabilitas spermatozoa didokumentasikan dengan baik, masih terbuka pertanyaan tentang kemungkinan perubahan integritas DNA sperma setelah prosedur pembekuan-pencairan. Tidak ada kesepakatan dalam literatur baik tentang apakah kriopreservasi menginduksi kerusakan DNA maupun jumlah kerusakan. Dalam beberapa penelitian, penulis telah melaporkan perubahan yang signifikan dari integritas DNA sperma setelah kriopreservasi/pencairan [6, 40], sedangkan penelitian lain menyatakan pendapat yang berbeda [41, 42]. Kontroversi antara satu studi dan yang lain pertama-tama dapat dijelaskan oleh fakta bahwa temuan tidak mengacu pada sejumlah besar sampel dan juga karena penggunaan (1) prosedur pembekuan yang berbeda, (2) tes yang berbeda untuk mengevaluasi integritas DNA, dan (3) teknik preparasi semen yang berbeda sebelum kriopreservasi (yaitu, swimup atau sentrifugasi gradien densitas). Sebagai contoh, Donnelly dan rekan [6] menyelidiki integritas DNA pra-kriopreservasi dan pascakriopreservasi dari kedua semen dan sampel sperma yang disiapkan (sentrifugasi gradien kepadatan atau swimup langsung) pada 50 pria. Mereka melaporkan bahwa membekukan sperma dalam plasma mani meningkatkan integritas DNA pasca pencairan: sperma-beku yang tidak disiapkan dalam cairan mani tampaknya lebih tahan terhadap kerusakan akibat pembekuan daripada sperma yang telah dibekukan Peningkatan lebih lanjut dapat dicapai dengan menyiapkan sperma dan membekukan setelah pembacaan plasma mani. Ini mungkin karena adanya antioksidan yang melimpah dalam plasma mani. Mengenai variabilitas terkait dengan prosedur pembekuan yang berbeda, dalam studi Petym dan rekan [43], penulis mengevaluasi cryodamage pada kromatin sperma membandingkan dua prosedur yang berbeda: uap nitrogen cair versus program freezer komputerisasi. Mereka menganalisis 50 sampel semen menggunakan acridine orange dan menyimpulkan bahwa kerusakan DNA secara signifikan lebih tinggi setelah pembekuan dengan nitrogen cair.

Dari analisis terperinci dari referensi yang saat ini tersedia dalam literatur, ditemukan bahwa pada dasarnya ada tiga garis pemikiran yang berbeda tentang pertanyaan: “Apakah prosedur pembekuan-pencairan menyebabkan kerusakan DNA sperma?”.

Menurut beberapa penulis jawabannya adalah “YA" (Tabel 2(a)). Spano dan kelompoknya [44] melaporkan bahwa kualitas sperma secara keseluruhan memburuk setelah pembekuan-pencairan, termasuk integritas DNA sperma yang dinilai oleh SCSA pada 19 sampel. Temuan ini telah dikonfirmasi dalam sebuah penelitian oleh De Paula dan rekan [40] pada 77 pasien, di mana penulis telah mengevaluasi tingkat fragmentasi DNA sperma dengan uji TUNEL sebelum dan sesudah kriopreservasi: penulis menekankan bahwa prosedur pembekuan-pencairan berdampak negatif integritas DNA. Selanjutnya, dari data yang dipublikasikan dalam literatur, juga jelas bahwa di antara penulis yang berpendapat bahwa kriopreservasi menginduksi kerusakan DNA sperma terkadang tidak ada kesepakatan tentang mekanisme yang sebenarnya menyebabkan kerusakan tersebut. Misalnya, terlepas dari kenyataan bahwa ROS dilaporkan secara luas memainkan peran penting dalam patofisiologi kerusakan spermatozoa manusia, termasuk fragmentasi DNA, Zribi dan kelompoknya [45] menyatakan bahwa tidak ada hubungan antara fragmentasi DNA dan oksidasi DNA. . Mereka menyarankan bahwa kriopreservasi menginduksi fragmentasi DNA sperma melalui jalur lain selain stres oksidatif, seperti cacat pada enzim perbaikan DNA atau peningkatan cacat yang sudah ada dalam sel sperma. Hipotesis ini ditentang oleh Thomson dan rekan [46]: meskipun menggunakan teknik yang sama untuk menilai oksidasi DNA, uji fluoresen untuk mendeteksi 8 oxoguanine, mereka melaporkan bahwa fragmentasi DNA sperma manusia dikaitkan dengan peningkatan stres oksidatif selama kriopreservasi. , daripada aktivasi caspase dan apoptosis.

Tentang pertanyaan “Apakah prosedur pembekuan-pencairan menyebabkan kerusakan DNA sperma?” beberapa penulis mengikuti alur pemikiran dan jawaban lain”YA, tapi dengan beberapa syarat” (Tabel 2(b)). Mereka mendukung hipotesis kerentanan yang lebih rendah terhadap kerusakan beku pada spermatozoa pria subur, yang diklasifikasikan menggunakan kriteria WHO, dibandingkan pria tidak subur. Dalam studi Donnelly dkk [6], sampel semen diperoleh dari 17 pria subur dan 40 pria tidak subur, dan integritas sperma dinilai sebelum dan sesudah kriopreservasi menggunakan uji Comet. Para penulis menunjukkan bahwa air mani dari pria subur tampaknya lebih tahan terhadap kerusakan pembekuan daripada sampel dari pria tidak subur. Selain itu, pada pria subur, tidak ada penurunan yang signifikan dalam integritas DNA setelah kriopreservasi. Hasil ini mendukung pengamatan bahwa spermatozoa dari pria tidak subur memiliki insiden yang lebih besar dari organisasi kromatin tidak teratur dan menunjukkan penurunan resistensi yang signifikan terhadap denaturasi termal dibandingkan dengan spermatozoa dari pria subur [47, 48]. Faktanya, sebagai akibat dari penurunan protaminasi, spermatozoa berkualitas buruk seringkali mengandung kromatin yang terdekondensasi sebagian yang menghasilkan ketidakmatangan fungsional [6]. Kondensasi kromatin sangat penting bagi spermatozoa karena spermatogenesis menghasilkan pembuangan sitoplasma, sehingga spermatozoa tidak mampu melakukan perbaikan DNA. Menurut hipotesis ini, Kalthur dkk [49], mengevaluasi morfologi sperma dan kerusakan DNA sperma sebelum dan sesudah kriopreservasi, melaporkan bahwa kerentanan sperma yang abnormal secara morfologis terhadap kerusakan DNA selama proses pembekuan secara signifikan lebih tinggi daripada sperma dengan morfologi normal. Mereka berhipotesis bahwa sperma dengan kelainan kepala mungkin telah mengubah sifat fisik membran dan dengan demikian telah mengubah toleransi terhadap stres dingin. Namun, tidak ada penelitian yang dilakukan untuk menilai apakah sperma yang abnormal secara morfologis dapat mempertahankan integritas kromatinnya selama kriopreservasi.

Bertentangan dengan dua jawaban atas pertanyaan di atas, ada garis pemikiran ketiga: beberapa penulis mengatakan: “TIDAK, prosedur pembekuan-pencairan tidak membahayakan integritas DNA sperma” (Tabel 2(c)). Sebagai contoh, Duru dan kelompoknya [41] mengevaluasi efek kriopreservasi pada fragmentasi DNA dan integritas membran pada 21 pasien menggunakan uji TUNEL dan annexin V. Hasil mereka menunjukkan bahwa kriopreservasi mengubah simetri membran plasma dan dikaitkan dengan translokasi fosfatidilserin, sedangkan Integritas DNA tetap terjaga. Selain itu, Isachenko dan rekan [42], membandingkan efek pembekuan lambat dan vitrifikasi pada integritas DNA sperma tanpa adanya krioprotektan, menemukan bahwa integritas DNA tidak terpengaruh oleh kriopreservasi. Kurangnya efek kriopreservasi pada DNA sperma juga telah dikonfirmasi oleh data Paasch dan rekan [50]. Mereka menunjukkan bahwa kriopreservasi secara signifikan terkait dengan gangguan potensi membran mitokondria, serta aktivasi caspase 3, 8, dan 9, tetapi tidak ada perubahan signifikan yang diamati dalam fragmentasi DNA, sebagaimana dinilai oleh uji TUNEL pada 84 sampel.

Bahkan jika pendapat tentang masalah “kriopreservasi dan kerusakan DNA” masih sangat kontroversial, evaluasi dampak kriopreservasi pada kromatin sperma sangat penting. Demikian juga, integritas DNA sperma merupakan faktor penting untuk keberhasilan ART [51-53].

4. Hasil Kriopreservasi dan Reproduksi

Kriopreservasi secara luas diketahui dapat meningkatkan motilitas sperma yang terganggu dan menurunkan tingkat pembuahan melalui efek yang merugikan pada membran, struktur akrosom, dan aktivitas akrosin [54]. Prosedur pembekuan-pencairan spermatozoa manusia juga dapat merusak struktur kromatin [55], yang menyebabkan potensi risiko dekondensasi inti sperma setelah injeksi ke dalam oosit, sehingga mengurangi tingkat pembuahan [56]. Namun, efek kumulatif kriopreservasi pada kapasitas fertilisasi sperma belum diketahui secara pasti. Mengingat penurunan daya fertilisasi sperma yang disebabkan oleh kriopreservasi, dapat dengan mudah dipahami bahwa inseminasi intrauterin dan inseminasi konvensional in vitro Fertilisasi (IVF) dengan spermatozoa beku-cair menghasilkan tingkat kehamilan yang lebih rendah dibandingkan dengan inseminasi dengan sperma segar [1]: inilah alasan mengapa kriopreservasi sampel semen sebelum inseminasi intrauterin atau IVF konvensional tidak dianjurkan.

Pertimbangannya berbeda untuk injeksi sperma intracytoplasmic (ICSI), karena prosedur ini hanya membutuhkan sejumlah kecil spermatozoa motil untuk keberhasilan pembuahan. Oleh karena itu, pertanyaan saat ini adalah apakah menggunakan sel sperma segar daripada sel sperma yang diawetkan memiliki efek yang sama pada hasil reproduksi di ICSI. Sampai saat ini, hanya beberapa penelitian skala besar tentang hasil reproduksi ICSI yang membandingkan spermatozoa ejakulasi, testis, atau epididimis manusia segar dan beku yang telah dilaporkan dalam literatur, dan hasilnya tampaknya berbeda antara penulis juga tergantung pada asal spermatozoa yang digunakan.

4.1. Spermatozoa testis

Friedler dan rekan [57] melaporkan tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik dalam semua parameter yang diperiksa (tingkat fertilisasi, tingkat pembelahan, kualitas embrio, tingkat implantasi, tingkat kehamilan klinis, dan tingkat kehamilan yang sedang berlangsung) antara siklus ICSI dengan spermatozoa testis segar atau cryopreserved dari pasien yang sama. , membandingkan semua siklus ICSI yang dilakukan dengan spermatozoa testis segar (25 siklus) dan yang dicairkan (14 siklus). Hipotesis ini didukung oleh penelitian beberapa penulis: Ben Rhouma dkk [58] melakukan total 60 siklus ICSI dengan spermatozoa testis segar (32 siklus) dan yang dicairkan (28 siklus) Habermann dan rekan [59] melakukan total 46 Siklus ICSI dengan spermatozoa testis segar (12 siklus) dan yang dicairkan (34 siklus) Huang dan rekan [60] melakukan total 22 siklus ICSI dengan spermatozoa testis segar (14 siklus) dan yang dicairkan (8 siklus). Semua penulis melaporkan hasil yang sama: hasil reproduksi ICSI dengan spermatozoa testis beku yang dicairkan sebanding dengan hasil reproduksi ICSI yang diperoleh dengan spermatozoa testis segar. Sebaliknya, De Croo dan rekan [61] menyatakan bahwa fertilisasi, implantasi, dan tingkat kelahiran hidup per transfer embrio secara signifikan lebih rendah setelah ICSI dengan beku-cair (35 siklus) dibandingkan dengan segar (65 siklus) spermatozoa testis.

4.2. Spermatozoa epididimis

Di sisi lain, beberapa kelompok membandingkan hasil injeksi sperma intracytoplasmic (ICSI) dengan spermatozoa epididimis segar dan beku-cair. Sebagai contoh, Tournaye dkk [62] melaporkan bahwa tingkat kehamilan klinis dalam siklus ICSI sebanding antara spermatozoa epididimis segar (157 siklus) dan beku-cair (118 siklus). Sukcharoen dan rekan [63] melakukan total 53 siklus ICSI dengan spermatozoa epididimis segar (40 siklus) dan dicairkan (13 siklus) dan sampai pada kesimpulan yang sama juga Cayan dan rekan [64] mendukung pendapat yang sama. Dalam oposisi Shibahara dkk [65] menyatakan bahwa ada perbedaan yang signifikan dalam semua parameter reproduksi diperiksa antara siklus ICSI dengan spermatozoa epididimis segar atau cryopreserved, membandingkan siklus ICSI dilakukan dengan segar (5 siklus) dan dicairkan (13 siklus) spermatozoa epididimis.

4.3. Spermatozoa yang ejakulasi

Sebagian besar penelitian tentang kriopreservasi dan hasil reproduksi ICSI dilakukan dengan menggunakan spermatozoa asal testis atau epididimis. Hanya dua kelompok besar yang melaporkan data tentang pembuahan dan tingkat kehamilan setelah ICSI membandingkan spermatozoa ejakulasi manusia segar dan beku yang dicairkan. Pertama, Kucznynski dan rekan [66] membandingkan hasil reproduksi dari 118 siklus ICSI menggunakan spermatozoa segar dan 122 siklus ICSI menggunakan spermatozoa beku-cair, semua dari pasien oligoasthenoteratozoospermic. Para penulis tidak melaporkan perbedaan yang signifikan secara statistik dalam tingkat pembuahan antara kedua kelompok pasien. Selain itu, data ini menunjukkan bahwa nilai kehamilan yang sedang berlangsung secara signifikan lebih tinggi pada pasien ICSI ketika sampel sperma manusia dikriopreservasi. Menurut Ragni dan kelompoknya [67], ini menunjukkan bahwa kriopreservasi yang dilakukan dengan benar secara selektif mempengaruhi spermatozoa yang cacat daripada sperma yang normal [44]. Pengamatan ini tampaknya menunjukkan bahwa kriopreservasi sebelum ICSI mungkin membantu untuk menghilangkan spermatozoa tua atau kekurangan, sehingga meningkatkan hasil reproduksi [62]. Borges dan kelompoknya [68] juga menyelidiki efek kriopreservasi sperma pada hasil ICSI. Penulis membandingkan 61 dan 79 siklus ICSI dilakukan dengan cryopreserved dan spermatozoa ejakulasi segar dan, khususnya, memeriksa hasil reproduksi yang diperoleh dengan menggunakan sampel semen dengan motilitas yang menurun dan normal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa (1) menggunakan semen dengan motilitas normal hasil reproduksi yang diperoleh menggunakan spermatozoa segar atau beku-cair adalah sama (2) pada semen dengan penurunan motilitas tingkat fertilisasi dengan sperma segar lebih tinggi dibandingkan dengan yang cryopreserved, tetapi tidak perbedaan terdeteksi pada implantasi dan kehamilan. Temuan ini mendukung hipotesis bahwa prosedur pembekuan-pencairan menyebabkan lebih banyak kerusakan pada pasien dengan perubahan kualitas air mani dibandingkan pada pasien dengan air mani normal. Namun, setelah oosit dibuahi, tingkat implantasi dan kehamilan serupa pada pasien dengan atau tanpa anomali sperma.

5. Kesimpulan

Saat ini, kriopreservasi sperma banyak digunakan untuk menyimpan spermatozoa donor dan mitra sebelum perawatan reproduksi berbantuan, untuk mengawetkan spermatozoa sebelum terapi penyakit ganas, vasektomi, atau perawatan infertilitas bedah dan untuk memastikan pemulihan sejumlah kecil spermatozoa pada infertilitas faktor pria yang parah. Oleh karena itu, kriopreservasi sperma merupakan komponen penting dari manajemen kesuburan, dan sebagian besar keberhasilan penerapannya tampaknya mempengaruhi hasil reproduksi ART.

Sementara efek kriopreservasi pada sel didokumentasikan dengan baik, hingga saat ini tidak ada kesepakatan dalam literatur tentang apakah kriopreservasi mempengaruhi integritas kromatin sperma atau tidak atau pada penggunaan protokol unik dan fungsional untuk prosedur pembekuan-pencairan. Hal ini menunjukkan bahwa, sampai saat ini, akan berguna untuk melakukan studi multisenter dengan sejumlah besar spesimen semen yang dapat diproses menggunakan protokol pembekuan yang unik. Selain itu, meskipun penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk memahami sepenuhnya pengaruh nyata kriopreservasi pada integritas DNA sperma dan dampak penggunaan spermatozoa kriopreservasi pada hasil reproduksi, langkah-langkah teknis harus diterapkan untuk memberikan perlindungan maksimal pada gamet jantan: penggunaan yang tepat dari cryoprotectants sebelum dan teknologi seleksi sperma setelah cryopreservation tampaknya memiliki dampak terbesar dalam mencegah fragmentasi DNA, sehingga meningkatkan tingkat cryosurvival sperma.

Referensi

  1. J. K. Sherman, “Sinopsis penggunaan semen manusia yang dibekukan sejak tahun 1964: state of the art of human semen banking,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 24, tidak. 5, hlm. 397–412, 1973. Lihat di: Google Cendekia
  2. W. G. Sanger, J. H. Olson, dan J. K. Sherman, "Cryobanking semen untuk pria dengan kanker' Perubahan kriteria," Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 58, tidak. 5, hlm. 1024–1027, 1992. Lihat di: Google Cendekia
  3. J. R. Jensen, D. E. Morbeck, dan C. C. Coddington III, “Pelestarian kesuburan,” Prosiding Mayo Clinic, jilid. 86, tidak. 1, hlm. 45–49, 2011. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  4. J. T. Anger, B. R. Gilbert, dan M. Goldstein, “Kriopreservasi sperma: indikasi, metode, dan hasil,” Jurnal Urologi, jilid. 170, tidak. 4 I, hlm. 1079–1084, 2003. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  5. G. J. Morris, E. Acton, dan S. Avery, "Sebuah pendekatan baru untuk kriopreservasi sperma," Reproduksi Manusia, jilid. 14, tidak. 4, hlm. 1013–1021, 1999. Lihat di: Google Cendekia
  6. E. T. Donnelly, N. McClure, dan S. E. M. Lewis, “Kriopreservasi semen manusia dan sperma yang disiapkan: efek pada parameter motilitas dan integritas DNA,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 76, tidak. 5, hlm. 892–900, 2001. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  7. R. Fabbri, P. Ciotti, B. Di Tommaso dkk., “Tecniche di crioconservazione riproduttiva,” Rivista Italiana di Ostetricia e Ginecologia, jilid. 3, hlm. 33–41, 2004. Lihat di: Google Cendekia
  8. S. J. Behrman dan Y. Sawada, “Inseminasi heterolog dan homolog dengan semen manusia yang dibekukan dan disimpan dalam lemari es nitrogen cair,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 17, tidak. 4, hlm. 457–466, 1966. Lihat di: Google Cendekia
  9. T. M. Said, A. Gaglani, dan A. Agarwal, “Implikasi apoptosis pada cryoinjury sperma,” BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 21, tidak. 4, hlm. 456–462, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  10. M. Mahadevan dan A. O. Trounson, “Pengaruh laju pendinginan, pembekuan dan pencairan dan kondisi penyimpanan terhadap pengawetan spermatozoa manusia,” Andrologi, jilid. 16, tidak. 1, hlm. 52–60, 1984. Lihat di: Google Cendekia
  11. J. V. Thachil dan M. A. S. Jewett, “Teknik pengawetan air mani manusia,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 35, tidak. 5, hlm. 546–548, 1981. Lihat di: Google Cendekia
  12. W. V. Holt, "Aspek dasar penyimpanan beku semen," Ilmu Reproduksi Hewan, jilid. 62, tidak. 1𠄳, hlm. 3-22, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  13. P. Mazur, W. F. Rall, dan N. Rigopoulos, “Kontribusi relatif dari fraksi air yang tidak dibekukan dan konsentrasi garam terhadap kelangsungan hidup eritrosit manusia yang dibekukan secara perlahan,” Jurnal Biofisika, jilid. 36, tidak. 3, hlm. 653–675, 1981. Lihat di: Google Cendekia
  14. J. Sherman, "Kriopreservasi air mani manusia," di Buku Pegangan Diagnosis Laboratorium dan Pengobatan Infertilitas, B. Keel dan B. W. Webster, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla, AS, 1990. Lihat di: Google Cendekia
  15. F. Abdelhafez, M. Bedaiwy, S. A. El-Nashar, E. Sabanegh, dan N. Desai, “Teknik untuk kriopreservasi individu atau sejumlah kecil spermatozoa manusia: tinjauan sistematis,” Pembaruan Reproduksi Manusia, jilid. 15, tidak. 2, hlm. 153–164, 2009. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  16. D. Royere, C. Barthelemy, S. Hamamah, dan J. Lansac, "Kriopreservasi spermatozoa: tinjauan 1996," Pembaruan Reproduksi Manusia, jilid. 2, tidak. 6, hlm. 553–559, 1996. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  17. P. F. Watson, “Penyebab berkurangnya kesuburan dengan semen kriopreservasi,” Ilmu Reproduksi Hewan, jilid. 60-61, hlm. 481–492, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  18. P. Stanic, M. Tandara, Z. Sonicki, V. Simunic, B. Radakovic, dan E. Suchanek, “Perbandingan media pelindung dan teknik pembekuan untuk kriopreservasi semen manusia,” Jurnal Eropa Obstetri Ginekologi dan Biologi Reproduksi, jilid. 91, tidak. 1, hlm. 65–70, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  19. A. Arav, Y. Zeron, S. B. Leslie, E. Behboodi, G. B. Anderson, dan J. H. Crowe, “Suhu transisi fase dan sensitivitas dingin oosit sapi,” Kriobiologi, jilid. 33, tidak. 6, hlm. 589–599, 1996. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  20. Y. Zeron, M. Pearl, A. Borochov, dan A. Arav, “Faktor kinetik dan temporal mempengaruhi cedera dingin pada vesikel germinal dan oosit sapi dewasa,” Kriobiologi, jilid. 38, tidak. 1, hlm. 35–42, 1999. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  21. M. N. Giraud, C. Motta, D. Boucher, dan G. Grizard, “Fluiditas membran memprediksi hasil kriopreservasi spermatozoa manusia,” Reproduksi Manusia, jilid. 15, tidak. 10, hlm. 2160–2164, 2000. Lihat di: Google Cendekia
  22. P. J. Quinn, "Model pemisahan fase lipid dari kerusakan suhu rendah pada membran biologis," Kriobiologi, jilid. 22, tidak. 2, hlm. 128–146, 1985. Lihat di: Google Cendekia
  23. T. Talaei, T. Esmaeelpour, F. Aekiyash, dan S. Bahmanpour, "Efek cryopreservation pada glikokonjugat membran plasma spermatozoa manusia," Jurnal Kedokteran Reproduksi Iran, jilid. 8, tidak. 3, hlm. 119–124, 2010. Lihat di: Google Cendekia
  24. S. Benoff, “Karbohidrat dan pemupukan: gambaran umum,” Reproduksi Manusia Molekuler, jilid. 3, tidak. 7, hlm. 599–637, 1997. Lihat di: Google Cendekia
  25. N. L. Cross dan J. W. Overstreet, "Glycoconjugates dari permukaan sperma manusia: distribusi dan perubahan yang menyertai kapasitasi in vitro," Penelitian Gamet, jilid. 16, tidak. 1, hlm. 23–35, 1987. Lihat di: Google Cendekia
  26. B. Lassalle dan J. Testart, "Pengenalan zona pellucida manusia terkait dengan penghilangan asam sialat dari permukaan sperma manusia," Jurnal Reproduksi dan Kesuburan, jilid. 101, tidak. 3, hlm. 703–711, 1994. Lihat di: Google Cendekia
  27. M. O'Connell, N. McClure, dan S. E. M. Lewis, "Efek cryopreservation pada morfologi sperma, motilitas dan fungsi mitokondria," Reproduksi Manusia, jilid. 17, tidak. 3, hlm. 704–709, 2002. Lihat di: Google Cendekia
  28. W. C. L. Ford dan J. M. Rees, "The bioenergetics motilitas sperma mamalia," di Kontrol Motilitas Sperma: Aspek Biologis dan Klinis, C. Gagnon, Ed., hlm. 175–202, CRC Press, Boca Raton, Fla, AS, 1990. Lihat di: Google Cendekia
  29. L. Zamboni, "Patologi ultrastruktural spermatozoa sebagai penyebab infertilitas: peran mikroskop elektron dalam evaluasi kualitas semen," Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 48, tidak. 5, hlm. 711–734, 1987. Lihat di: Google Cendekia
  30. R. A. Saleh dan A. Agarwal, “Stres oksidatif dan infertilitas pria: dari bangku penelitian hingga praktik klinis,” Jurnal Andrologi, jilid. 23, tidak. 6, hlm. 737–752, 2002. Lihat di: Google Cendekia
  31. J. L. Lasso, E. E. Noiles, J. G. Alvarez, dan B. T. Storey, “Mekanisme hilangnya superoksida dismutase dari sel sperma manusia selama kriopreservasi,” Jurnal Andrologi, jilid. 15, tidak. 3, hlm. 255–265, 1994. Lihat di: Google Cendekia
  32. X. Wang, R. K. Sharma, S. C. Sikka, A. J. Thomas, T. Falcone, dan A. Agarwal, “Stres oksidatif dikaitkan dengan peningkatan apoptosis yang menyebabkan kerusakan DNA spermatozoa pada pasien dengan infertilitas faktor pria,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 80, tidak. 3, hlm. 531–535, 2003. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  33. D. S. McClintock, M. T. Santore, V. Y. Lee et al., “Anggota keluarga Bc1-2 dan rantai transpor elektron fungsional mengatur kematian sel yang diinduksi kekurangan oksigen,” Biologi Molekuler dan Seluler, jilid. 22, tidak. 1, hlm. 94-104, 2002. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  34. D. Arnoult, B. Gaume, M. Karbowski, J. C. Sharpe, F. Cecconi, dan R. J. Youle, “Rilis mitokondria AIF dan EndoG membutuhkan aktivasi caspase di hilir permeabilisasi yang dimediasi Bax/Bak,” Jurnal EMBO, jilid. 22, tidak. 17, hlm. 4385–4399, 2003. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  35. G. Martin, N. Cagnon, O. Sabido et al., "Kinetika terjadinya beberapa fitur apoptosis selama proses kriopreservasi spermatozoa sapi," Reproduksi Manusia, jilid. 22, tidak. 2, hlm. 380–388, 2007. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  36. J. C. Martinez-Soto, J. De Dioshourcade, A. Gutiérrez-Adán, J. L. Landeras, dan J. Gadea, “Pengaruh suplementasi genistein media pencairan pada karakteristik spermatozoa manusia beku,” Jurnal Andrologi Asia, jilid. 12, tidak. 3, hlm. 431–441, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  37. C. S. Branco, M. E. Garcez, F. F. Pasqualotto, B. Erdtman, dan M. Salvador, “Resveratrol dan asam askorbat mencegah kerusakan DNA yang disebabkan oleh kriopreservasi dalam air mani manusia,” Kriobiologi, jilid. 60, tidak. 2, hlm. 235–237, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  38. K. Taylor, P. Roberts, K. Sanders, dan P. Burton, "Pengaruh suplementasi antioksidan media cryopreservation pada integritas pasca pencairan spermatozoa manusia," BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 18, tidak. 2, hlm. 184–189, 2009. Lihat di: Google Cendekia
  39. Z. Li, Q. Lin, R. Liu, W. Xiao, dan W. Liu, “Efek perlindungan askorbat dan katalase pada spermatozoa manusia selama kriopreservasi,” Jurnal Andrologi, jilid. 31, tidak. 5, hlm. 437–444, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  40. T. S. de Paula, R. P. Bertolla, D. M. Spaine, M. A. Cunha, N. Schor, dan A. P.Cedenho, “Pengaruh kriopreservasi pada fragmentasi asam deoksiribonukleat apoptosis sperma pada pasien dengan oligozoospermia,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 86, tidak. 3, hlm. 597–600, 2006. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  41. N. K. Duru, M. S. Morshedi, A. Schuffner, dan S. Oehninger, “Cryopreservation-thawing dari fraksinasi spermatozoa manusia dikaitkan dengan eksternalisasi fosfatidilserin membran dan bukan fragmentasi DNA,” Jurnal Andrologi, jilid. 22, tidak. 4, hlm. 646–651, 2001. Lihat di: Google Cendekia
  42. E. Isachenko, V. Isachenko, I. I. Katkov et al., “Integritas DNA dan motilitas spermatozoa manusia setelah pembekuan lambat standar versus vitrifikasi bebas krioprotektan,” Reproduksi Manusia, jilid. 19, tidak. 4, hlm. 932–939, 2004. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  43. S. Petyim dan R. Choavaratana, “Kerusakan pada kromatin sperma menurut metode pembekuan yang berbeda, dinilai dengan uji AO,” Jurnal Asosiasi Medis Thailand, jilid. 89, tidak. 3, hlm. 306–313, 2006. Lihat di: Google Cendekia
  44. M. Spanò, E. Cordelli, G. Leter, F. Lombardo, A. Lenzi, dan L. Gandini, “Variasi kromatin inti pada spermatozoa manusia yang menjalani swim-up dan kriopreservasi dievaluasi dengan uji struktur kromatin sperma sitometrik, ” Reproduksi Manusia Molekuler, jilid. 5, tidak. 1, hlm. 29–37, 1999. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  45. N. Zribi, N. Feki Chakroun, H. El Euch, J. Gargouri, A. Bahloul, dan L. Ammar Keskes, "Pengaruh kriopreservasi pada integritas asam deoksiribonukleat sperma manusia," Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 93, tidak. 1, hlm. 159–166, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  46. L. K. Thomson, S. D. Fleming, R. J. Aitken, G. N. De Iuliis, J. A. Zieschang, dan A. M. Clark, “Kerusakan DNA sperma manusia yang diinduksi cryopreservation sebagian besar dimediasi oleh stres oksidatif daripada apoptosis,” Reproduksi Manusia, jilid. 24, tidak. 9, hlm. 2061–2070, 2009. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  47. D. P. Evenson, Z. Darzynkiewicz, dan M. R. Melamed, “Perbandingan struktur kromatin sperma manusia dan tikus dengan flow cytometry,” kromosom, jilid. 78, tidak. 2, hlm. 225–238, 1980. Lihat di: Google Cendekia
  48. D. P. Evenson dan M. R. Melamed, “Analisis cepat jenis sel normal dan abnormal dalam semen manusia dan biopsi testis dengan flow cytometry,” Jurnal Histokimia dan Sitokimia, jilid. 31, tidak. 1 A, hlm. 248–253, 1983. Lihat di: Google Cendekia
  49. G. Kalthur, S. K. Adiga, D. Upadhya, S. Rao, dan P. Kumar, “Pengaruh kriopreservasi pada integritas DNA sperma pada pasien dengan teratospermia,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 89, tidak. 6, hlm. 1723–1727, 2008. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  50. U. Paasch, R. K. Sharma, A. K. Gupta et al., "Cryopreservation dan pencairan dikaitkan dengan berbagai tingkat aktivasi mesin apoptosis dalam himpunan bagian spermatozoa manusia yang diejakulasikan," Biologi Reproduksi, jilid. 71, tidak. 6, hlm. 1828–1837, 2004. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  51. R. J. Aitken dan G. N. De Iuliis, “Asal usul dan konsekuensi kerusakan DNA pada sel germinal pria,” BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 14, tidak. 6, hlm. 727–733, 2007. Lihat di: Google Cendekia
  52. N. Tarozzi, D. Bizzaro, C. Flamigni, dan A. Borini, “Relevansi klinis kerusakan DNA sperma dalam reproduksi berbantuan,” BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 14, tidak. 6, hlm. 746–757, 2007. Lihat di: Google Cendekia
  53. A. Zini, J. M. Boman, E. Belzile, dan A. Ciampi, “Kerusakan DNA sperma dikaitkan dengan peningkatan risiko keguguran setelah IVF dan ICSI: tinjauan sistematis dan meta-analisis,” Reproduksi Manusia, jilid. 23, tidak. 12, hlm. 2663–2668, 2008. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  54. N. L. Cross dan S. E. Hanks, "Efek cryopreservation pada akrosom sperma manusia," Reproduksi Manusia, jilid. 6, tidak. 9, hlm. 1279-1283, 1991. Lihat di: Google Cendekia
  55. D. Royere, S. Hamamah, J. C. Nicolle, dan J. Lansac, “Perubahan kromatin yang disebabkan oleh pembekuan-pencairan mempengaruhi kemampuan pembuahan sperma manusia,” Jurnal Internasional Andrologi, jilid. 14, tidak. 5, hlm. 328–332, 1991. Lihat di: Google Cendekia
  56. D. Sakkas, F. Urner, P. G. Bianchi et al., “Anomali kromatin sperma dapat mempengaruhi dekondensasi setelah injeksi sperma intracytoplasmic,” Reproduksi Manusia, jilid. 11, tidak. 4, hlm. 837–843, 1996. Lihat di: Google Cendekia
  57. S. Friedler, D. Strassburger, A. Raziel, D. Komarovsky, Y. Soffer, dan R. Ron-El, “Injeksi intracytoplasmic spermatozoa testis segar dan cryopreserved pada pasien dengan azoospermia nonobstructive studi perbandingan,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 68, tidak. 5, hlm. 892–897, 1997. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  58. K. Ben Rhouma, H. Marrakchi, H. Khouja, K. Attalah, E. Ben Miled, dan M. Sakly, "Hasil injeksi intracytoplasmic spermatozoa testis segar dan beku-cair: studi perbandingan," Jurnal Kedokteran Reproduksi untuk Dokter Kandungan dan Ginekolog, jilid. 48, tidak. 5, hlm. 349–354, 2003. Lihat di: Google Cendekia
  59. H. Habermann, R. Seo, J. Cieslak, C. Niederberger, G. S. Prins, dan L. Ross, “Hasil fertilisasi in vitro setelah injeksi sperma intracytoplasmic dengan spermatozoa testis segar atau beku yang dicairkan,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 73, tidak. 5, hlm. 955–960, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  60. F. J. Huang, S. Y. Chang, M. Y. Tsai et al., "Implikasi klinis injeksi sperma intracytoplasmic menggunakan spermatozoa testis cryopreserved dari pria dengan azoospermia," Jurnal Kedokteran Reproduksi untuk Ahli Obstetri dan Ginekologi, jilid. 45, tidak. 4, hlm. 310–316, 2000. Lihat di: Google Cendekia
  61. I. D. Croo, J. Van Der Elst, K. Everaert, P. D. Sutter, dan M. Dhont, “Fertilisasi, tingkat kehamilan dan implantasi embrio setelah ICSI dengan spermatozoa testis segar atau beku-cair,” Reproduksi Manusia, jilid. 13, tidak. 7, hlm. 1893–1897, 1998. Lihat di: Google Cendekia
  62. H. Tournaye, T. Merdad, S. Silber et al., “Tidak ada perbedaan hasil setelah injeksi sperma intracytoplasmic dengan spermatozoa epididimis segar atau beku-cair,” Reproduksi Manusia, jilid. 14, tidak. 1, hlm. 90–95, 1999. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  63. N. Sukcharoen, T. Sithipravej, S. Promviengchai, V. Chinpilas, dan W. Boonkasemsanti, “Perbandingan hasil injeksi sperma intracytoplasmic menggunakan spermatozoa epididimis segar dan beku yang diperoleh dengan aspirasi sperma epididimis perkutan,” Jurnal Asosiasi Medis Thailand, jilid. 84, tidak. 1, hlm. S331–S337, 2001. Lihat di: Google Cendekia
  64. S. Cayan, D. Lee, J. Conaghan et al., “Perbandingan hasil ICSI dengan spermatozoa epididimis segar dan cryopreserved dari pasangan yang sama,” Reproduksi Manusia, jilid. 16, tidak. 3, hlm. 495–499, 2001. Lihat di: Google Cendekia
  65. H. Shibahara, Y. Hamada, A. Hasegawa et al., "Korelasi antara motilitas spermatozoa epididimis beku-cair dan hasil injeksi sperma intracytoplasmic," Jurnal Internasional Andrologi, jilid. 22, tidak. 5, hlm. 324–328, 1999. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  66. W. Kuczyski, M. Dhont, C. Grygoruk, D. Grochowski, S. Woczyski, dan M. Szamatowicz, “Hasil dari injeksi intracytoplasmic dari spermatozoa ejakulasi segar dan cryopreserved studi acak prospektif,” Reproduksi Manusia, jilid. 16, tidak. 10, hlm. 2109–2113, 2001. Lihat di: Google Cendekia
  67. G. Ragni, A. M. Caccamo, A. Dalla Serra, dan S. Guercilena, “Pembekuan semen bertahap terkomputerisasi dari pria dengan tumor testis atau penyakit Hodgkin mempertahankan sperma lebih baik daripada pembekuan uap standar,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 53, tidak. 6, hlm. 1072–1075, 1990. Lihat di: Google Cendekia
  68. E. Borges Jr., L. M. Rossi, C. V. Locambo de Freitas et al., “Pembuahan dan hasil kehamilan setelah injeksi intracytoplasmic dengan spermatozoa ejakulasi segar atau cryopreserved,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 87, tidak. 2, hlm. 316–320, 2007. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  69. A. Borini, E. Sereni, M. A. Bonu, dan C. Flamigni, “Membekukan beberapa spermatozoa testis yang diambil oleh TESA,” Endokrinologi Molekuler dan Seluler, jilid. 169, tidak. 1-2, hlm. 27–32, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  70. J. Cohen, G. J. Garrisi, T. A. Congedo-Ferrara, K. A. Kieck, T. W. Sehimmel, dan R. T. Scott, “Kriopreservasi spermatozoa manusia tunggal,” Reproduksi Manusia, jilid. 12, tidak. 5, hlm. 994–1001, 1997. Lihat di: Google Cendekia
  71. R. Walmsley, J. Cohen, T. Ferrara-Congedo, A. Reing, dan J. Garrisi, "Kelahiran pertama dan kehamilan berkelanjutan terkait dengan kriopreservasi sperma dalam zona telur yang dievakuasi," Reproduksi Manusia, jilid. 13, tidak. 4, hlm. 61–70, 1998. Lihat di: Google Cendekia
  72. M. Montag, K. Rink, U. Dieckmann, G. Delacrétaz, dan H. Van Der Ven, “kriopreservasi dengan bantuan laser dari spermatozoa manusia tunggal di zona bebas sel pellucida,” Andrologi, jilid. 31, tidak. 1, hlm. 49–53, 1999. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  73. Y. Y. Hsieh, H. D. Tsai, C. C. Chang, dan H. Y. Lo, “Kriopreservasi spermatozoa manusia dalam zona pellucidae kosong manusia atau tikus,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 73, tidak. 4, hlm. 694–698, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  74. J. Liu, X. Z. Zheng, T. A. Baramki, G. Compton, R. A. Yazigi, dan E. Katz, “Kriopreservasi sejumlah kecil spermatozoa testis manusia segar dan spermatozoa testis yang dikultur in vitro selama 3 hari di zona pellucida yang kosong,” Jurnal Andrologi, jilid. 21, tidak. 3, hlm. 409–413, 2000. Lihat di: Google Cendekia
  75. P. E. Levi-Setti, E. Albani, L. Negri, A. Cesana, P. Novara, dan S. Bianchi, “Kriopreservasi sejumlah kecil spermatozoa di zona pellucidae manusia yang dipenuhi kuning telur,” Archivio Italiano di Urologia dan Andrologia, jilid. 75, tidak. 4, hlm. 195–198, 2003. Lihat di: Google Cendekia
  76. A. Cesana, P. Novara, S. Bianchi et al., "Kriopreservasi sperma pada pasien oligo-asthenospermia," di Prosiding Pertemuan Tahunan ke-19 Masyarakat Eropa untuk Reproduksi dan Embriologi Manusia, Madrid, Spanyol, Juli 2003. Lihat di: Google Cendekia
  77. H. Hassa, F. Gurer, A. Yildirim, C. Can, V. Sahinturk, dan B. Tekin, “Sebuah solusi perlindungan baru untuk membekukan sejumlah kecil sperma di dalam zona pellucida kosong: larutan Osmangazi-Turk,” Teknologi Pelestarian Sel, jilid. 4, tidak. 3, hlm. 199–208, 2006. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  78. M. Gil-Salom, J. Romero, C. Rubio, A. Ruiz, J. Remohí, dan A. Pellicer, "Injeksi sperma intracytoplasmic dengan spermatozoa testis cryopreserved," Endokrinologi Molekuler dan Seluler, jilid. 169, tidak. 1-2, hlm. 15–19, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  79. E. Sereni, M. A. Bonu, L. Fava et al., "Pembekuan spermatozoa yang diperoleh dengan aspirasi jarum halus testis: teknik baru," BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 16, tidak. 1, hlm. 89–95, 2008. Lihat di: Google Cendekia
  80. C. Quintans, M. Donaldson, I. Asprea et al., "Pengembangan pendekatan baru untuk kriopreservasi sejumlah kecil spermatozoa," Reproduksi Manusia, jilid. 15, hal. 99, 2000. Lihat di: Google Cendekia
  81. N. Bouamama, P. Briot, dan J. Testart, “Perbandingan dua metode cryoconservation sperma ketika dalam jumlah yang sangat kecil,” Kesuburan Kebidanan Ginekologi, jilid. 31, tidak. 2, hlm. 132–135, 2003. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  82. M. Gvakharia dan G. Adamson, “Sebuah metode kriopreservasi yang berhasil dari sejumlah kecil spermatozoa manusia,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 76, hal. S101, 2001. Lihat di: Google Cendekia
  83. J. O. Sohn, S. H. Jun, L. S. Park et al., “Perbandingan pemulihan dan viabilitas sperma dalam pipet ICSI setelah pembekuan ultra cepat atau pembekuan lambat,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 80, hal. S128, 2003. Lihat di: Google Cendekia
  84. A. Just, I. Gruber, M. Wr, J. Lahodny, A. Obruca, dan H. Strohmer, “Metode baru untuk kriopreservasi sperma testis dan spermatozoa ejakulasi dari pasien dengan oligospermia berat: studi percontohan,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 82, tidak. 2, hlm. 445–447, 2004. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  85. A. Herrler, S. Eisner, V. Bach, U. Weissenborn, dan H. M. Beier, "Kriopreservasi spermatozoa dalam kapsul asam alginat," Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 85, tidak. 1, hlm. 208–213, 2006. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  86. F. Nawroth, V. Isachenko, S. Dessole et al., “Vitrifikasi spermatozoa manusia tanpa krioprotektan,” Cryo-Letter, jilid. 23, tidak. 2, hlm. 93–102, 2002. Lihat di: Google Cendekia
  87. T. G. Schuster, L. M. Keller, R. L. Dunn, D. A. Ohl, dan G. D. Smith, “Pembekuan sangat cepat dari jumlah sperma yang sangat rendah menggunakan cryoloops,” Reproduksi Manusia, jilid. 18, tidak. 4, hlm. 788–795, 2003. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  88. N. Desai, C. Culler, dan J. Goldfarb, “Kriopreservasi sperma tunggal dari sampel epididimis dan testis pada cryoloops: laporan kasus awal,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 82, hal. S264, 2004. Lihat di: Google Cendekia
  89. N. N. Desai, H. Blackmon, dan J. Goldfarb, “Kriopreservasi sperma tunggal pada cryoloops: alternatif zona hamster untuk membekukan spermatozoa individu,” BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 9, tidak. 1, hlm. 47–53, 2004. Lihat di: Google Cendekia
  90. D. A. Isaev, S. Y. Zaletov, dan W. Zaeva, "Mikrokontainer buatan untuk kriopreservasi spermatozoa soliter," di Prosiding Pertemuan Tahunan ke-23 Masyarakat Eropa untuk Reproduksi dan Embriologi Manusia, P. 394, Lyon, Prancis, Juli 2007. Lihat di: Google Cendekia
  91. N. Desai, D. Glavan, dan J. Goldfarb, “Sebuah teknik yang nyaman untuk kriopreservasi sejumlah mikro sperma,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 70, hlm. S197–S198, 1998, Suplemen program pertemuan tahunan. Lihat di: Google Cendekia
  92. V. Isachenko, E. Isachenko, M. Montag et al., "Teknik bersih untuk vitrifikasi sperma manusia tanpa krioprotektan," BioMedicine Reproduksi Online, jilid. 10, tidak. 3, hlm. 350–354, 2005. Lihat di: Google Cendekia
  93. I. Koscinski, C. Wittemer, V. Lefebvre-Khalil, F. Marcelli, A. Defossez, dan J. M. Rigot, “Manajemen optimal oligozoospermia ekstrem dengan program kriopreservasi yang tepat,” Reproduksi Manusia, jilid. 22, tidak. 10, hlm. 2679–2684, 2007. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  94. S. Hamamah, D. Royere, J. C. Nicolle, M. Paquignon, dan J. Lansac, "Efek pembekuan-pencairan pada inti spermatozoa: studi sitofotometri kromatin komparatif pada spesies babi dan manusia," Perkembangan Nutrisi Reproduksi, jilid. 30, tidak. 1, hlm. 59–64, 1990. Lihat di: Google Cendekia
  95. M. E. Hammadeh, C. Dehn, M. Hippach et al., “Perbandingan antara metode pembekuan uap nitrogen cair tahap lambat dan statis terkomputerisasi sehubungan dengan efek merusak pada kromatin dan morfologi spermatozoa dari pria subur dan subfertil,” Jurnal Internasional Andrologi, jilid. 24, tidak. 2, hlm. 66–72, 2001. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  96. L. Gandini, F. Lombardo, A. Lenzi, M. Spanò, dan F. Dondero, “Kriopreservasi dan integritas DNA sperma,” Perbankan Sel dan Jaringan, jilid. 7, tidak. 2, hlm. 91–98, 2006. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  97. T. Ngamwuttiwong dan S. Kunathikom, “Evaluasi cryoinjury kromatin sperma menurut metode uap nitrogen cair (I),” Jurnal Asosiasi Medis Thailand, jilid. 90, tidak. 2, hlm. 224–228, 2007. Lihat di: Google Cendekia
  98. S. Dejarkom dan S. Kunathikom, “Evaluasi cryo-injury kromatin sperma menurut metode pembekuan laju yang dikendalikan komputer bagian 2,” Jurnal Asosiasi Medis Thailand, jilid. 90, tidak. 5, hlm. 852–856, 2007. Lihat di: Google Cendekia
  99. L. Ahmad, S. Jalali, S. A. Shami, Z. Akram, S. Batool, dan O. Kalsoom, “Pengaruh kriopreservasi pada integritas DNA sperma pada pria normal dan empat kategori infertil,” Sistem Biologi dalam Kedokteran Reproduksi, jilid. 56, tidak. 1, hlm. 74–83, 2010. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google
  100. E. Høst, S. Lindenberg, J. A. Kahn, dan F. Christensen, “Pemutusan untai DNA dalam sel sperma manusia: perbandingan antara pria dengan sampel sperma normal dan oligozoospermia,” Acta Obstetricia dan Gynecologica Scandinavica, jilid. 78, tidak. 4, hlm. 336–339, 1999. Lihat di: Google Cendekia
  101. E. K. Steele, N. McClure, dan S. E. M. Lewis, “Perbandingan efek dua metode kriopreservasi pada DNA sperma testis,” Kesuburan dan Kemandulan, jilid. 74, tidak. 3, hlm. 450–453, 2000. Lihat di: Situs Penerbit | beasiswa Google

Hak cipta

Hak Cipta © 2012 Marlea Di Santo dkk.Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan karya aslinya dikutip dengan benar.


Tonton videonya: Program Hamil Dengan Dokter Suryo Bawono Pekanbaru- Cara Membaca Analisa Hasil Sperma (Agustus 2022).