Informasi

Mengapa pengurutan Sanger lebih rendah untuk mendeteksi SNP dalam sel kanker?

Mengapa pengurutan Sanger lebih rendah untuk mendeteksi SNP dalam sel kanker?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya akrab dengan sekuensing Sanger, tetapi pada tingkat sarjana. Seorang dosen saya mencoba menggambarkan sekuensing Sanger sebagai kehilangan informasi sekuens dalam kebisingan saat digunakan untuk mendeteksi kanker. Makalah ini juga mengatakan "kurang sensitifitas yang memadai untuk mendeteksi alel mutan dalam biopsi tumor," (Thomas dkk., 2006). Ada apa dengan Sanger yang membuatnya terlalu tidak sensitif untuk analisis SNP?

Thomas, R., K., dkk. (2006) Deteksi mutasi sensitif pada spesimen kanker heterogen dengan sekuensing reaktor picoliter paralel masif. Nat. Med. 12, 852-855


Dalam pendekatan Sanger, DNA akan diisolasi dari biopsi dan akan mengandung alel normal dan alel mutan dari gen yang terkait dengan perkembangan tumor. Jika, misalnya, amplifikasi PCR kemudian digunakan untuk menurunkan sampel dari wilayah templat target, bahan ini akan berakhir diurutkan sebagai populasi campuran: urutan turunan akan menjadi rata-rata populasi urutan itu, dan alel langka akan menjadi bertopeng

Perbedaan utama dalam sebagian besar pendekatan generasi berikutnya adalah bahwa DNA templat "dikloning" secara fisik (misalnya dengan memisahkan molekul individu menjadi tetesan, atau dengan mengikatnya ke permukaan) sehingga urutan molekul individu ini dapat ditentukan secara paralel. Pendekatan ini akan mengungkapkan polimorfisme terkait tumor ketika urutan molekul template individu dibandingkan.

Ditambahkan kemudian sebagai informasi tambahan.

Saya sekarang telah melihat kertas yang dikutip dalam pertanyaan. Kutipan dari Pendahuluan ini menegaskan poin utama saya tentang mengurutkan campuran templat yang berbeda hanya pada beberapa posisi kunci.

Meskipun umum digunakan dalam banyak pengaturan klinis, pengurutan rantai dideoksinukleotida (atau 'Sanger') dari produk PCR seringkali tidak memiliki sensitivitas yang cukup untuk mendeteksi alel mutan dalam biopsi tumor, di mana tingkat kegagalan telah mencapai 75% dalam beberapa kasus. Mutasi onkogenik gain-of-fungsi sering merupakan peristiwa heterozigot atau mungkin mewakili satu alel tunggal dari gen yang diperkuat; dengan demikian, sinyal untuk residu yang bermutasi biasanya berkurang relatif terhadap basa tetangga. Selain itu, kemampuan untuk mendeteksi mutasi basa tunggal atau penyisipan kecil atau penghapusan dalam bahan biopsi dengan sekuensing Sanger sangat bergantung pada kemurnian sampel (misalnya, tingkat kontaminasi DNA stroma) dan integritas DNA genom. Selanjutnya, resistensi terhadap inhibitor kinase mungkin berkorelasi dengan mutasi situs kedua frekuensi rendah. Pengamatan ini menggarisbawahi tantangan untuk deteksi mutasi yang akurat pada spesimen kanker.

Pendekatan sekuensing-by-sintesis paralel besar-besaran, 'pirosekuens pelat picotiter,' memberikan alternatif baru untuk pengurutan Sanger. Pendekatan ini bergantung pada amplifikasi klonal PCR berbasis emulsi dari perpustakaan DNA yang diadaptasi ke manik-manik berukuran mikron dan pirosequencing-by-sintesis berikutnya dari setiap templat yang diamplifikasi secara klon dalam pelat picotiter, menghasilkan lebih dari 200.000 pembacaan sekuensing klon unik per percobaan. Varian urutan yang mewakili sebagian kecil dari sampel kompleks dapat sangat banyak diambil sampelnya, sehingga memungkinkan kuantifikasi varian dengan kelimpahan rendah yang bermakna secara statistik.


Analisis komparatif sistematis metode deteksi varian nukleotida tunggal dari data sekuensing RNA sel tunggal

Interogasi sistematis varian nukleotida tunggal (SNV) adalah salah satu pendekatan yang paling menjanjikan untuk menggambarkan heterogenitas seluler dan hubungan filogenetik pada tingkat sel tunggal. Sementara deteksi SNV dari data sekuensing RNA sel tunggal (scRNA-seq) yang melimpah dapat diterapkan dan hemat biaya dalam mengidentifikasi varian yang diekspresikan, menyimpulkan sub-klon, dan menguraikan hubungan genotipe-fenotipe, ada kekurangan metode komputasi yang dikembangkan secara khusus untuk SNV memanggil di scRNA-seq. Meskipun pemanggil varian untuk RNA-seq massal telah digunakan secara sporadis di scRNA-seq, kinerja alat yang berbeda belum dinilai.

Hasil

Di sini, kami melakukan perbandingan sistematis tujuh alat termasuk SAMtools, pipa GATK, CTAT, FreeBayes, MuTect2, Strelka2, dan VarScan2, menggunakan set data simulasi dan scRNA-seq, dan mengidentifikasi beberapa elemen yang memengaruhi kinerjanya. Sementara spesifisitas umumnya tinggi, dengan sensitivitas melebihi 90% untuk sebagian besar alat saat memanggil SNV homozigot di daerah pengkodean yang sangat percaya diri dengan kedalaman baca yang cukup, sensitivitas tersebut menurun secara dramatis saat memanggil SNV dengan kedalaman baca rendah, frekuensi alel varian rendah, atau spesifik konteks genomik. SAMtools menunjukkan sensitivitas tertinggi dalam banyak kasus terutama dengan pembacaan yang mendukung rendah, meskipun spesifisitas yang relatif rendah di daerah intron atau identitas tinggi. Strelka2 menunjukkan kinerja yang baik secara konsisten ketika bacaan pendukung yang memadai disediakan, sementara FreeBayes menunjukkan kinerja yang baik dalam kasus frekuensi alel varian tinggi.

Kesimpulan

Kami merekomendasikan SAMtools, Strelka2, FreeBayes, atau CTAT, tergantung pada kondisi penggunaan tertentu. Studi kami memberikan pembandingan pertama untuk mengevaluasi kinerja berbagai alat deteksi SNV untuk data scRNA-seq.


Ikhtisar alur kerja

Thermo Fisher Scientific telah mengintegrasikan semua alat yang diperlukan untuk pengeditan genom dan analisis hilir (Gambar 1). Alat desain Invitrogen™ GeneArt™ memfasilitasi desain dan pemesanan gRNA spesifik target untuk pengeditan genom yang dimediasi CRISPR atau TAL untuk pengeditan genom yang dimediasi TALEN. Reagen transfeksi invitrogen menawarkan beberapa opsi untuk pengiriman alat pengeditan genom ke dalam sel eukariotik. Selain itu, vektor kloning TOPO™ TA Invitrogen dan sel yang kompeten memfasilitasi analisis urutan transforman primer. Media Gibco™ tersedia untuk menumbuhkan transforman primer dan kultur sekunder setelah ekspansi klon. Akhirnya, instrumen dan reagen sekuensing Biosistem Terapan memungkinkan penentuan peristiwa pengeditan genom tertentu. Dalam catatan aplikasi ini, kami mendemonstrasikan bagaimana alur kerja ini bersatu untuk menghasilkan dan mengidentifikasi mutasi pada gen human hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT).

Tinjauan singkat tentang langkah-langkah yang digunakan untuk menghasilkan dan menganalisis kultur primer dengan mutasi HPRT ditunjukkan pada Gambar 2. Urutan CRISPR RNA (crRNA) spesifik target dalam gRNA dirancang untuk lokus spesifik HPRT. GRNA disintesis melalui transkripsi in vitro menggunakan Invitrogen GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit. Setelah sintesis dan pemurnian, gRNA ditransfeksi bersama dengan Cas9 mRNA ke dalam sel 293FT menggunakan Reagen Transfeksi Invitrogen Lipofectamine™ MessengerMAX™. Sel-sel dipanen 78 jam pascatransfeksi. Lisis sel kemudian digunakan bersama dengan primer yang mengapit target HPRT untuk menghasilkan amplikon PCR yang panjangnya tidak lebih dari 600 bp. Produk PCR kemudian disubklon menggunakan Kit Kloning PCR TOPO Invitrogen Zero Blunt™ dan diubah menjadi sel Invitrogen TOP10 E. coli. Sembilan puluh enam koloni bakteri diambil per kumpulan sel yang diedit gen dan diproses untuk isolasi DNA menggunakan Sistem Pemurnian Plasmid Invitrogen PureLink™ 96 dan dikenai sekuensing Sanger. Data sekuensing yang dihasilkan kemudian dianalisis untuk mengukur persentase produk PCR yang mengandung sekuens yang diedit secara akurat dan untuk memilih isolat klon mana yang akan dipertahankan. Sebagai alternatif, meskipun tidak dilakukan untuk penelitian ini, produk PCR dapat diurutkan secara langsung, tanpa subkloning ke dalam sel TOPO.

Gambar 1. Alur kerja keseluruhan untuk pengeditan genom CRISPR. Thermo Fisher Scientific menyediakan alat, reagen, dan keahlian yang dibutuhkan untuk sukses di setiap langkah alur kerja.

Gambar 2. Langkah-langkah menentukan efisiensi edit menggunakan TOPO cloning dan Sanger sequencing oleh CE. 1. Transfect gRNA dan Cas9 mRNA ke dalam sel. 2. Inkubasi sel untuk memungkinkan pemrosesan perubahan genom. 3. Memurnikan DNA genom dari kultur sel, PCR-mengamplifikasi lokus yang direkayasa dari kultur heterogen, dan mengkloning fragmen PCR ke dalam vektor TOPO. 4. Pisahkan plasmid dari koloni tunggal dan PCR-amplifikasi sisipannya. 5. Urutan sisipan. Efisiensi pengeditan adalah rasio jumlah sisipan dengan perubahan rekayasa terhadap jumlah total sisipan yang diurutkan. Efisiensi yang lebih tinggi kemungkinan akan menghasilkan lebih sedikit klon sekunder yang perlu disaring untuk mengidentifikasi sel-sel tertentu dengan perubahan tersebut.


Pengembangan teknologi sekuensing RNA

Baru pada tahun 1953 ketika Watson dan Crick mengusulkan struktur heliks ganda, orang benar-benar menyadari pada tingkat molekuler bahwa esensi kehidupan adalah hasil interaksi gen [4]. Pengembangan sekuensing RNA yang berkelanjutan telah mengantarkan analisis transkriptom ke era baru, dengan efisiensi yang lebih tinggi dan biaya yang lebih rendah. Garis waktu teknologi sekuensing RNA ditunjukkan pada Gambar. 1.

Garis waktu pengembangan teknologi pengurutan RNA

Teknologi pengurutan generasi pertama juga disebut pengurutan Sanger. Metode pemutusan rantai diprakarsai oleh Sanger pada tahun 1977, diikuti oleh metode degradasi kimia yang dikembangkan oleh Maxam dan Gilbert [5, 6]. Pada tahun yang sama, Sanger menentukan genom 5368 bp dari fag X174, yang merupakan genom DNA pertama yang diurutkan [7]. Microarray DNA telah membantu kemajuan yang signifikan di banyak bidang sejak pertama kali diperkenalkan. Namun, microarray membutuhkan pengetahuan sebelumnya tentang urutan gen dan tidak dapat mengidentifikasi ekspresi gen baru [8]. Setelah platform pengurutan throughput tinggi pertama muncul pada tahun 2005 [1], beberapa platform pengurutan generasi berikutnya mengikuti (Tabel 1, Gambar 2, 3). Akurasi dan reproduktifitas di antara platform yang berbeda bergantung pada beberapa faktor, termasuk fitur yang melekat pada platform dan jalur analisis yang sesuai [9, 10]. Pyrosequencing yang tidak lagi didukung setelah tahun 2016, dikembangkan oleh 454 Life Sciences, menggunakan metode “sequencing by synthesis” [1, 11,12,13]. Platform pengurutan torrent ion juga didasarkan pada metode "pengurutan dengan sintesis", yang mengungguli pyrosequencing sehubungan dengan sensitivitas. SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) menunjukkan akurasi yang tinggi, karena setiap basa diurutkan dua kali, tetapi panjang bacanya pendek [11,12,13]. DNBS (DNA nanoball sequencing) memungkinkan koleksi besar DNA nanoballs untuk sequencing simultan. Teknologi pengurutan berbasis Illumina mewakili metode "pengurutan terminator yang dapat dibalik". Pengurutan throughput tinggi memiliki keunggulan kecepatan cepat, biaya pengurutan rendah, dan akurasi tinggi, atau dikenal sebagai pengurutan generasi berikutnya (NGS). Dibandingkan dengan microarray, ia dapat mendeteksi urutan ekspresi gen yang tidak diketahui tetapi membutuhkan waktu yang lama [14].

Ekstraksi RNA dan persiapan template sebelum RNA-sequencing. RNA diekstraksi dari jaringan, dan setelah fragmentasi, molekul DNA yang terfragmentasi diubah menjadi cDNA dengan transkripsi balik kemudian diamplifikasi dengan PCR emulsi atau PCR jembatan untuk menyiapkan pustaka sekuensing

Tiga jenis metode pengurutan. Metode-metode ini terdiri dari pengurutan dengan sintesis, pengurutan dengan terminator reversibel dan pengurutan dengan ligasi. Dan mekanisme mereka yang berbeda ditunjukkan secara rinci

Selain NGS, ada sekuensing generasi ketiga, yang memungkinkan pengurutan panjang baca molekul RNA individu [15]. Sekuensing RNA molekul tunggal memungkinkan pembuatan transkrip cDNA full-length tanpa amplifikasi klon atau perakitan transkrip. Dengan demikian, sekuensing generasi ketiga bebas dari kekurangan yang dihasilkan oleh amplifikasi PCR dan pemetaan baca. Ini dapat sangat mengurangi tingkat positif palsu dari situs splice dan menangkap keragaman isoform transkrip [15]. Platform pengurutan molekul tunggal terdiri dari sekuensing fluoresen molekul tunggal Pacific Biosciences (PacBio) real-time (SMRT) [16], pengurutan fluoresen molekul tunggal Helicos [17] dan pengurutan nanopore Oxford Nanopore Technologies (ONT) [18]. Selanjutnya, RNA-seq baru-baru ini berevolusi dari sekuensing massal ke sekuensing sel tunggal. Sekuensing RNA sel tunggal pertama kali diterbitkan pada tahun 2009 untuk membuat profil transkriptom pada resolusi sel tunggal [19]. Drop-Seq dan InDrop awalnya dilaporkan pada 2015 dengan menganalisis sel retina tikus dan transkriptom sel induk embrionik, mengidentifikasi jenis sel baru. Sci-RNA-seq, pengurutan RNA pengindeksan kombinatorial sel tunggal, dikembangkan pada tahun 2017, dan SPLiT-seq (pengurutan transkriptom berbasis ligasi split-pool) pertama kali dilaporkan pada tahun 2018. Kedua pendekatan menggunakan strategi pengindeksan kombinatorial di mana RNA terpasang diberi label dengan kode batang yang menunjukkan asal selulernya [20, 21].

Meskipun data sel tunggal memungkinkan transkriptomik sel tunggal, data tersebut mungkin kehilangan informasi spasial selama isolasi sel tunggal. Untuk mengatasi masalah ini, transkriptomik spasial telah muncul. Transkriptomik spasial menggunakan barcode posisi unik untuk memvisualisasikan distribusi RNA dalam sekuensing RNA bagian jaringan dan pertama kali diterbitkan pada tahun 2016 [22]. Slide-seq, dilaporkan pada tahun 2019, menggunakan manik-manik kode batang DNA dengan informasi posisi tertentu [23]. Geo-seq diperkenalkan pada tahun 2017 dan scRNA-seq terintegrasi dengan laser capture microdissection (LCM), yang dapat mengisolasi sel individu [24]. Sekuensing in situ mengacu pada pengurutan fragmen RNA yang ditargetkan dalam jaringan atau sel yang diawetkan secara morfologis tanpa ekstraksi RNA, termasuk sintesis cDNA in situ dengan probe gembok atau amplikon cDNA yang terhubung silang secara stabil dalam sekuensing RNA in situ fluoresen (FISSEQ) dan amplifikasi in situ dengan menggulung -lingkaran amplifikasi (RCA) [25, 26]. Selanjutnya, berbagai teknologi baru berdasarkan RNA-seq telah dikembangkan untuk aplikasi tertentu. Misalnya, jenis sekuensing RNA yang ditargetkan, CaptureSeq, menggunakan probe oligonukleotida terbiotinilasi dan menghasilkan pengayaan transkrip tertentu untuk mengidentifikasi fusi gen [27, 28].


Referensi

Darwin, C. Tentang Asal Usul Spesies (John Murray Press, 1859).

Luria, S. E. & Delbrück, M. Mutasi bakteri dari sensitivitas virus menjadi resistensi virus. Genetika 28, 491–511 (1943).

Cairns, seleksi J. Mutasi dan sejarah alami kanker. Alam 255, 197–200 (1975).

Fisher, R. et al. Sekuensing mendalam mengungkapkan mutasi resistensi protease kecil pada pasien yang gagal dengan rejimen inhibitor protease. J. Viral. 86, 6231–6237 (2012).

Schmitt, M. W., Loeb, L. A. & Salk, J. J. Pengaruh mutasi resistensi subklonal pada terapi kanker yang ditargetkan. Nat. Pdt. Klin. Onkol. 13, 335–347 (2016).

Maher, G.J. dkk. Memvisualisasikan asal-usul mutasi egois de novo pada tubulus seminiferus individu testis manusia. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 113, 2454–2459 (2016).

Kennedy, S. R., Loeb, L. A. & Herr, A. J. Mutasi somatik pada penuaan, kanker, dan degenerasi saraf. mekanisme Penuaan Dev. 133, 118–126 (2012).

Vijg, mutasi J. Somatik, mosaik genom, kanker dan penuaan. Curr. pendapat. gen. Dev. 26, 141–149 (2014).

Shendure, J. et al. Urutan DNA pada 40: masa lalu, sekarang dan masa depan. Alam 550, 345–353 (2017).

Goodwin, S., Mcpherson, J. D. & amp McCombie, W. R. Kedewasaan: sepuluh tahun teknologi pengurutan generasi berikutnya. Nat. Pdt. 17, 333–351 (2016).

Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, pengurutan DNA A. R. dengan inhibitor pemutus rantai. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 74, 5463–5467 (1977). Salah satu dari dua metodologi sekuensing DNA pemenang hadiah Nobel yang diterbitkan pada tahun 1977 (yang lainnya adalah Maxam dan Gilbert). Pendekatan Sanger menjadi dasar dari The Human Genome Project.

Ley, T.J. dkk. Urutan DNA dari genom leukemia myeloid akut yang secara sitogenetik normal. Alam 456, 66–72 (2008).

Zagordi, O., Klein, R., Däumer, M. & Beerenwinkel, N. Koreksi kesalahan data sekuensing generasi berikutnya dan estimasi quasispecies HIV yang andal. Asam Nukleat Res. 38, 7400–7409 (2010).

Parsons, B. L. & Heflich, R. H. Metode seleksi genotip untuk analisis langsung mutasi titik. mutasi. Res. 387, 97–121 (1997).

Bielas, J. H. & Loeb, L. A. Kuantifikasi mutasi genomik acak. Nat. Metode 2, 285–290 (2005).

Li, J.et al. Mengganti PCR dengan COLD-PCR memperkaya rangkaian DNA varian dan mengubah sensitivitas pengujian genetik. Nat. Med. 14, 579–584 (2008).

Sykes, P.J. dkk. Kuantitas target untuk PCR dengan menggunakan pengenceran terbatas. Bioteknik 13, 444–449 (1992).

Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. Digital, P. C. R. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 96, 9236–9241 (1999).

Hindson, B.J. dkk. Sistem PCR digital tetesan throughput tinggi untuk kuantisasi absolut nomor salinan DNA. dubur. Kimia 83, 8604–8610 (2011).

Fox, E. J., Reid-Bayliss, K. S., Emond, M. J. & amp Loeb, L. A. Akurasi platform pengurutan generasi berikutnya. Generasi Berikutnya. Seq. aplikasi 1, 1000106 (2014).

Blokzijl, F. et al. Akumulasi mutasi spesifik jaringan dalam sel induk manusia dewasa selama hidup. Alam 538, 260–264 (2016).

Ewing, B. & Green, P. Pemanggilan dasar pelacakan sequencer otomatis menggunakan phred. II. Probabilitas kesalahan. Res. Genom 8, 186–194 (1998). Di antara penggunaan pertama dan terpenting dari metode statistik ketat untuk menetapkan tingkat kepastian data sekuensing DNA.

Cock, P. J. A., Fields, C. J., Goto, N., Heuer, M. L. & Rice, P. M. Format file Sanger FASTQ untuk urutan dengan skor kualitas, dan varian FASTQ Solexa/Illumina. Asam Nukleat Res. 38, 1767–1771 (2010).

Cibulskis, K. et al. Deteksi sensitif mutasi titik somatik dalam sampel kanker yang tidak murni dan heterogen. Nat. Bioteknologi. 31, 213–219 (2013).

Koboldt, D.C. dkk. VarScan 2: mutasi somatik dan penemuan perubahan jumlah salinan pada kanker dengan sekuensing exome. Res. Genom 22, 568–576 (2012).

Wang, Q. dkk. Mendeteksi mutasi titik somatik dalam data sekuensing genom kanker: perbandingan pemanggil mutasi. Obat Genom. 5, 91 (2013).

Li, H. Menyelaraskan urutan membaca, mengkloning urutan dan contig perakitan dengan BWA-MEM. Pracetak di ArXiV arXiv:1303.3997v2 [q-bio.GN] (2013).

Wei, Z., Wang, W., Hu, P., Lyon, G. J. & Hakonarson, H. SNVer: alat statistik untuk pemanggilan varian dalam analisis kumpulan atau individu data sekuensing generasi berikutnya. Asam Nukleat Res. 39, e132–e132 (2011).

Wilm, A.et al. LoFreq: pemanggil varian ultra-sensitif yang sadar akan kualitas urutan untuk mengungkap heterogenitas populasi sel dari kumpulan data sekuensing throughput tinggi. Asam Nukleat Res. 40, 11189–11201 (2012).

Gerstung, M.et al. Deteksi andal varian nukleotida tunggal subklonal dalam populasi sel tumor. Nat. komuni. 3, 811 (2012).

Costello, M.et al. Penemuan dan karakterisasi mutasi artifaktual dalam cakupan mendalam menargetkan data sekuensing penangkapan karena kerusakan DNA oksidatif selama persiapan sampel. Asam Nukleat Res. 41, e67–e67 (2013).

Chen, L., Liu, P., Evans, T. C. & amp Ettwiller, L. M. Kerusakan DNA adalah penyebab umum kesalahan pengurutan, yang secara langsung mengacaukan identifikasi varian. Sains 355, 752–756 (2017).

Schirmer, M., D'Amore, R., Ijaz, U.Z., Hall, N. & Quince, C. Profil kesalahan Illumina: menyelesaikan variasi skala halus dalam data sekuensing metagenomik. Bioinformatika BMC 17, 125 (2016).

Martincorena, I.et al. Evolusi tumor. Beban tinggi dan seleksi positif mutasi somatik yang meresap pada kulit manusia normal. Sains 348, 880–886 (2015).

Welch, J.S. dkk. Asal usul dan evolusi mutasi pada leukemia myeloid akut. Sel 150, 264–278 (2012).

Nik-Zainal, S.et al. Lanskap mutasi somatik dalam 560 sekuens seluruh genom kanker payudara. Alam 534, 47–54 (2016).

Kircher, M., Sawyer, S. & Meyer, M. Pengindeksan ganda mengatasi ketidakakuratan dalam pengurutan multipleks pada platform Illumina. Asam Nukleat Res. 40, e3 (2012). Deskripsi penting tentang kesamaan chimaera PCR, duplikat optik, dan pertukaran indeks yang terjadi selama persiapan perpustakaan NGS dan pembentukan poloni. Ini berkontribusi pada praktik pengindeksan ganda yang sekarang umum untuk aplikasi yang sensitif terhadap kesalahan.

Potapov, V. & amp Ong, J. L. Memeriksa sumber kesalahan dalam PCR dengan sekuensing molekul tunggal. PLOS SATU 12, e0169774 (2017).

Brodin, J. et al. Transisi yang diinduksi PCR adalah sumber kesalahan utama dalam data pyrosequencing ultra-dalam yang dibersihkan. PLOS SATU 8, e70388 (2013).

Bintang, B. dkk. Artefak urutan palindromik yang dihasilkan selama persiapan perpustakaan sekuensing generasi berikutnya dari DNA bersejarah dan kuno. PLOS SATU 9, e89676 (2014).

Van Allen, E.M. dkk. Sekuensing seluruh exome dan interpretasi klinis sampel tumor tertanam parafin yang difiksasi formalin untuk memandu pengobatan kanker presisi. Nat. Med. 20, 682–688 (2014).

Arbeithuber, B., Makova, K. D. & Tiemann-Boege, I. Mutasi artifaktual yang dihasilkan dari lesi DNA membatasi tingkat deteksi dalam aplikasi pengurutan ultrasensitif. DNA Res. 23, 547–559 (2016).

Lindahl, T. & Nyberg, B. Tingkat depurinasi asam deoksiribonukleat asli. Biokimia 11, 3610–3618 (1972).

Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M. & amp Seelow, D. Perbandingan sistematis tiga metode untuk fragmentasi produk PCR jarak jauh untuk pengurutan generasi berikutnya. PLOS SATU 6, e28240 (2011).

Do, H. & Dobrovic, A. Urutan artefak dalam DNA dari jaringan tetap formalin: penyebab dan strategi untuk meminimalkan. klinik Kimia 61, 64–71 (2015).

Lou, D.I. dkk. Kesalahan pengurutan DNA throughput tinggi dikurangi dengan urutan besarnya menggunakan pengurutan lingkaran. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 110, 19872–19877 (2013). Deskripsi penting pertama dari sekuensing konsensus dengan duplikasi tandem molekul perpustakaan. Meskipun menantang pada pengurutan bacaan pendek, konsep ini kemungkinan akan menjadi sangat penting karena pengurutan molekul tunggal meningkat di tahun-tahun mendatang.

Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M.-T. & Eshleman, J. R. Deaminasi sitosin adalah penyebab utama kebisingan dasar dalam pengurutan generasi berikutnya. Mol Diagnosa Ada. 18, 587–593 (2014).

Schaaper, R. M., Kunkel, T. A. & Loeb, L. A. Ketidaksetiaan sintesis DNA terkait dengan bypass situs apurin. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 80, 487–491 (1983).

Sagher, D. & Strauss, B. Penyisipan nukleotida berlawanan situs apurinic / apyrimidinic dalam asam deoksiribonukleat selama sintesis in vitro: keunikan nukleotida adenin. Biokimia 22, 4518–4526 (1983).

Nishimura, S. 8-Hydroxyguanine: dasar untuk penemuan. Perbaikan DNA 10, 1078–1083 (2011).

Sinha, R. dkk. Pergantian indeks menyebabkan 'penyebaran sinyal' di antara sampel yang digandakan dalam pengurutan DNA Illumina HiSeq 4000. https://doi.org/10.1101/125724 (2017).

Hiatt, J. B., Turner, E. H., Patwardhan, R. P., Caperton, L. & amp Shendure, J. Sekuensing DNA generasi berikutnya untuk perakitan genom de novo. Forum Penelitian Medis Mahasiswa Barat (2009).

Hiatt, J. B., Patwardhan, R. P., Turner, E. H., Lee, C. & amp Shendure, J. Parallel, perakitan tag-diarahkan dari urutan pendek yang diturunkan secara lokal berbunyi. Nat. Metode 7, 119–122 (2010). Deskripsi pertama tentang duplikat PCR sekuensing konsensus untuk koreksi kesalahan, baik dengan UMI maupun tanpa UMI.

Casbon, J. A., Osborne, R. J., Brenner, S. & amp Lichtenstein, C. P. Metode untuk menghitung molekul template PCR dengan aplikasi untuk sekuensing generasi berikutnya. Asam Nukleat Res. 39, e81 (2011).

Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Deteksi dan kuantifikasi mutasi langka dengan sekuensing paralel besar-besaran. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 108, 9530–9535 (2011). Deskripsi awal utama dari koreksi kesalahan berbasis tag untai tunggal untuk deteksi varian langka. Publikasi ini menempatkan signifikansi dalam konteks klinis dan mungkin merupakan peluncuran yang paling penting untuk lapangan.

Jabara, C. B., Jones, C. D., Roach, J., Anderson, J. A. & Swanstrom, R. Pengambilan sampel yang akurat dan pengurutan yang dalam dari gen protease HIV-1 menggunakan ID Primer. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 108, 20166–20171 (2011).

Fu, G. K., Hu, J., Wang, P.-H. & Fodor, S. P. A. Menghitung molekul DNA individu dengan pelekatan stokastik berbagai label. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 108, 9026–9031 (2011).

Kivioja, T.et al. Menghitung jumlah absolut molekul menggunakan pengidentifikasi molekul unik. Nat. Metode 9, 72–74 (2011).

Shiroguchi, K., Jia, T. Z., Sims, P. A. & Xie, X. S. Urutan RNA digital meminimalkan bias yang bergantung pada urutan dan kebisingan amplifikasi dengan barcode molekul tunggal yang dioptimalkan. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 109, 1347–1352 (2012).

Schmitt, M.W. dkk. Deteksi mutasi ultra-langka dengan pengurutan generasi berikutnya. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 109, 14508–14513 (2012). Deskripsi awal DupSeq dan konsep pelabelan salinan dari kedua untai molekul untai ganda individu untuk memungkinkan mereka untuk diurutkan dan dibandingkan untuk akurasi yang lebih besar. Teknik ini membuka pintu untuk penyelidikan varian ultra-langka, seperti yang terjadi pada penuaan dan dengan paparan bahan kimia mutagenik.

Hoang, M. L. dkk. Kuantifikasi genom-lebar dari mutasi somatik langka dalam jaringan manusia normal menggunakan sekuensing paralel besar-besaran. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 113, 9846–9851 (2016). Pendekatan pengurutan dupleks pada kedalaman yang sangat rendah dan tidak memerlukan UMI eksogen. Contoh yang sangat baik dari genotoksisitas dan aplikasi penuaan.

Nachmanson, D.et al. CRISPR-DS: metode input DNA rendah yang efisien untuk pengurutan ultra-akurat. Pracetak di bioRxivhttps://doi.org/10.1101/207027 (2017).

Liang, R.H. dkk. Penilaian teoretis dan eksperimental dari penandaan primer yang merosot dalam aplikasi pengurutan generasi berikutnya yang sangat dalam. Asam Nukleat Res. 42, e98 (2014).

Zhang, T.-H., Wu, N. C. & Sun, R. Studi benchmark tentang koreksi kesalahan dengan memasangkan baca dan pengelompokan tag dalam pengurutan dalam berbasis amplikon. BMC Genomics 17, 108 (2016).

Smith, T., Heger, A. & Sudbery, I. UMI-tools: pemodelan kesalahan pengurutan dalam Unique Molecular Identifiers untuk meningkatkan akurasi kuantifikasi. Res. Genom 27, 491–499 (2017).

Ståhlberg, A. et al. Sederhana, multipleks, barcode DNA berbasis PCR memungkinkan deteksi mutasi sensitif dalam biopsi cair menggunakan pengurutan. Asam Nukleat Res. 44, e105 (2016).

Ståhlberg, A. et al. Barcoding DNA berbasis PCR multipleks sederhana untuk deteksi mutasi ultrasensitif dengan sekuensing generasi berikutnya. Nat. Protoc. 12, 664–682 (2017).

Hiatt, J. B., Pritchard, C. C., Salipante, S. J., O'Roak, B. J. & amp Shendure, J. Probe inversi molekul molekul tunggal untuk deteksi akurasi tinggi yang ditargetkan dari variasi frekuensi rendah. Res. Genom https://doi.org/10.1101/gr.147686.112 (2013).

Carlson, K. D. dkk. MIPSTR: metode untuk multipleks genotipe germline dan variasi STR somatik di banyak individu. Res. Genom 25, 750–761 (2015).

Boyle, E. A., O'Roak, B. J., Martin, B. K., Kumar, A. & amp Shendure, J. MIPgen: pemodelan dan desain probe inversi molekul yang dioptimalkan untuk pengurutan ulang yang ditargetkan. Bioinformatika 30, 2670–2672 (2014).

Wang, K.et al. Deteksi mutasi ultra-presisi dengan amplifikasi DNA sirkular berbasis tetesan. BMC Genomics 17, 214 (2016). Deskripsi penting dari beberapa teknik biokimia untuk meningkatkan efisiensi pembuatan konsensus dan mengurangi biaya.

Hong, L.Z. dkk. BAsE-Seq: metode untuk mendapatkan haplotipe virus yang panjang dari pembacaan urutan pendek. Biola genom. 15, 517 (2014).

Schmitt, M. W., Fox, E. J. & amp Salk, J. J. Risiko penghitungan ganda dalam pengurutan mendalam. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 111, E1560 (2014).

Hong, J. & Gresham, D. Penggabungan pengidentifikasi molekul unik dalam adaptor TruSeq meningkatkan akurasi pengurutan kuantitatif. Bioteknik 63, 221–226 (2017).

Narayan, A.et al. Pengukuran ultrasensitif mutasi hotspot dalam DNA tumor dalam darah menggunakan pengurutan dalam multipleks yang ditekan kesalahan. Kanker Res. 72, 3492–3498 (2012).

Gregory, M.T. dkk. Deteksi mutasi molekul tunggal yang ditargetkan dengan sekuensing paralel masif. Asam Nukleat Res. 44, e22–e22 (2016).

Pel, J.et al. Duplex Proximity Sequencing (Pro-Seq): metode untuk meningkatkan akurasi pengurutan DNA tanpa biaya redundansi barcode molekuler. Pracetak di bioRxiv https://doi.org/10.1101/163444 (2017).

Kennedy, S.R. dkk. Mendeteksi mutasi frekuensi ultra rendah dengan pengurutan dupleks. Nat. Protoc. 9, 2586–2606 (2014).

Roach, J.C. dkk. Analisis pewarisan genetik dalam kuartet keluarga dengan sekuensing seluruh genom. Sains 328, 636–639 (2010).

Kennedy, S. R., Salk, J. J., Schmitt, M. W. & Loeb, L. A. Urutan ultra-sensitif mengungkapkan peningkatan terkait usia dalam mutasi mitokondria somatik yang tidak konsisten dengan kerusakan oksidatif. PLOS Gen. 9, e1003794 (2013). Deskripsi pertama dari sekuensing konsensus akurasi tinggi untuk mengukur efek penuaan manusia pada beban mutasi somatik.

Taylor, P. H., Cinquin, A. & Cinquin, O. Kuantifikasi akrual mutasi progenitor in vivo dengan tingkat kesalahan sangat rendah dan DNA input minimal menggunakan SIP-HAVA-seq. Res. Genom 26, 1600–1611 (2016).

Hoekstra, J. G., Hipp, M. J., Montine, T. J. & amp Kennedy, S. R. Mutasi DNA mitokondria meningkat pada penyakit Alzheimer tahap awal dan tidak konsisten dengan kerusakan oksidatif. Ann. saraf. 80, 301–306 (2016).

Pickrell, A. M. et al. Parkin endogen mempertahankan neuron substantia nigral dopaminergik setelah stres mutagenik DNA mitokondria neuron 87, 371–381 (2015).

Reid-Bayliss, K. S., Arron, S. T., Loeb, L. A., Bezrookove, V. & Cleaver, J. E. Mengapa pasien sindrom Cockayne tidak terkena kanker meskipun mereka kekurangan perbaikan DNA. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 113, 10151–10156 (2016).

Chawanthayatham, S. et al. Spektrum mutasi aflatoksin B1 in vivo menetapkan biomarker paparan untuk karsinoma hepatoseluler manusia Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 114, E3101–E3109 (2017).

Mattox, A.K. dkk. Dupleks yang dikonversi bisulfit untuk deteksi spesifik untai dan kuantifikasi mutasi langka. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 114, 4733–4738 (2017).

Kumar, V. dkk. Konversi bisulfit parsial untuk pengurutan template yang unik. Asam Nukleat Res. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1054 (2017).

Deamer, D., Akeson, M. & amp Branton, D. Tiga dekade sequencing nanopore. Nat. Bioteknologi. 34, 518–524 (2016).

Idul Fitri, J.et al. Sekuensing DNA real-time dari molekul polimerase tunggal. 323, 133–138 (2009).

Madoui, M.-A. dkk. Perakitan genom menggunakan pembacaan DNA panjang dan bebas kesalahan yang dipandu nanopore. BMC Genomics 16, 327 (2015).

Schüle, B. et al. Penyakit Parkinson terkait dengan ekspansi berulang ATXN10 murni. NPJ Parkinson Dis. 3, 27 (2017).

Li, C.et al. INC-Seq: pembacaan molekul tunggal yang akurat menggunakan pengurutan nanopore. Gigascience 5, 34 (2016).

Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B. & amp Akeson, M. Oxford Nanopore MinION: pengiriman pengurutan nanopore ke komunitas genomik. Biola genom. 17, 239 (2016).

Travers, K. J., Chin, C.-S., Rank, D. R., Eid, J. S. & Turner, S. W. Format template yang fleksibel dan efisien untuk pengurutan konsensus melingkar dan deteksi SNP. Asam Nukleat Res. 38, e159 (2010). Deskripsi pertama dari sekuensing konsensus berdasarkan pengurutan ulang berulang dari kedua untaian molekul individu. Konsep ini, meskipun saat ini menantang, mungkin akan menjadi sangat penting karena sekuenser DNA molekul tunggal meningkat.

Loomis, E.W. dkk. Mengurutkan yang tidak dapat diurutkan: alel pengulangan CGG yang diperluas dari gen X yang rapuh. Res. Genom 23, 121–128 (2013).

Russo, G.et al. Deteksi mutasi kanker kolorektal yang sangat sensitif dan non-invasif menggunakan molekul tunggal, sekuensing generasi ketiga. aplikasi Terjemahkan Genom. 7, 32–39 (2015).

Frank, J.A. dkk. Rakitan metagenom yang ditingkatkan dan binning taksonomi menggunakan data urutan konsensus melingkar yang telah lama dibaca. Sci. Reputasi. 6, 25373 (2016).

Hestand, M. S., Van Houdt, J., Cristofoli, F. & Vermeesch, J. R. Polymerase tingkat kesalahan spesifik dan profil diidentifikasi oleh sekuensing molekul tunggal. mutasi. Res. 784–785, 39–45 (2016).

Heerema, S. J. & amp Dekker, perangkat nano C. Graphene untuk pengurutan DNA. Nat. nanoteknologi. 11, 127–136 (2016).

Beechem, J. Library pengurutan target gratis sampel FFPE DNA genomik asli menggunakan teknologi Hyb & Seq-sistem pengurutan molekul tunggal berbasis hibridisasi. Kemajuan dalam Pertemuan Tahunan Biologi dan Teknologi Genom https://www.nanostring.com/application/files/3815/0206/1895/AGBT2017_HybSeq_Chemistry_Final.pdf (2017).

Johnson, S. S., Zaikova, E., Goerlitz, D. S., Bai, Y. & Tighe, S. W. Sekuensing DNA real-time di lembah kering Antartika menggunakan sequencer Oxford Nanopore. J. Biomol. Teknologi. 28, 2–7 (2017).

Wang, K.et al. Menggunakan sekuensing generasi berikutnya yang sangat sensitif untuk membedah mutagenesis yang diinduksi kerusakan DNA Sci. Reputasi. 6, 25310 (2016).

Stoler, N., Arbeithuber, B., Guiblet, W., Makova, K. D. & Nekrutenko, A. Analisis efisien data sekuensing dupleks dengan Du Novo. Biola genom. 17, 180 (2016).

Newman, A.M.et al. Penekanan kesalahan digital terintegrasi untuk meningkatkan deteksi DNA tumor yang bersirkulasi. Nat. Bioteknologi. 34, 547–555 (2016). Deskripsi komprehensif awal yang penting dari pendekatan biopsi cair cfDNA menggunakan teknik koreksi kesalahan berbasis tag.

Zheng, Z.et al. PCR multipleks berlabuh untuk pengurutan generasi berikutnya yang ditargetkan. Nat. Med. 20, 1479–1484 (2014).

Kennedy, S. & Hipp, MJ Menghapus sekuenser dan artefak PCR untuk analisis DNA forensik pada platform sekuensing paralel masif: https://www.promega.com/-/media/files/products-and-services/genetic-identity/ishi -28-oral-abstracts/kennedy-ishipaper.pdf (2017).

Krimmel, J.D., Salk, J.J. & Risques, R.-A. Mutasi mirip kanker pada jaringan non-kanker: menuju pemahaman yang lebih baik tentang karsinogenesis bertingkat. Transl Kanker Res. https://doi.org/10.21037/tcr.2016.11.67 (2016).

Loeb, L. A., Springgate, C. F. & Battula, N. Kesalahan dalam replikasi DNA sebagai dasar perubahan ganas. Kanker Res. 34, 2311–2321 (1974).

Merlo, L. M. F., Pepper, J. W., Reid, B. J. & Maley, C. C. Kanker sebagai proses evolusi dan ekologi. Nat. Pdt. Kanker 6, 924–935 (2006).

Gatenby, R. A. & Gillies, R. J. Model lingkungan mikro karsinogenesis. Nat. Pdt. Kanker 8, 56–61 (2008).

Salk, J. J., Fox, E. J. & amp Loeb, L. A. Heterogenitas mutasi pada kanker manusia: asal dan konsekuensi. annu. Pdt. Pathol. 5, 51–75 (2010).

Greaves, M. & Maley, C. C. Evolusi klonal pada kanker. Alam 481, 306–313 (2012).

Burrell, R. A., McGranahan, N., Bartek, J. & amp Swanton, C. Penyebab dan konsekuensi heterogenitas genetik dalam evolusi kanker. Alam 501, 338–345 (2013).

Gerlinger, M.et al. Heterogenitas intratumor dan evolusi bercabang diungkapkan oleh sekuensing multiregion. N. Inggris. J. Med. 366, 883–892 (2012).

Sottoriva, A.et al. Heterogenitas intratumor pada glioblastoma manusia mencerminkan dinamika evolusi kanker Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 110, 4009–4014 (2013).

Zhang, J.et al. Heterogenitas intratumor pada adenokarsinoma paru terlokalisasi yang digambarkan oleh sekuensing multiregion. Sains 346, 256–259 (2014).

de Bruin, E.C. dkk. Keragaman spasial dan temporal dalam proses ketidakstabilan genom mendefinisikan evolusi kanker paru-paru. Sains 346, 251–256 (2014).

Naxerova, K.et al. DNA hypermutable mencatat evolusi kanker usus besar manusia. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 111, E1889–E1898 (2014).

Reiter, J. G. et al. Merekonstruksi pola penyemaian metastasis kanker manusia. Nat. komuni. 8, 14114 (2017).

Marusyk, A. et al. Penggerak pertumbuhan tumor non-sel-otonom mendukung heterogenitas sub-klonal Alam 514, 54–58 (2014).

Yates, L.R. dkk. Diversifikasi subklonal kanker payudara primer diungkapkan oleh sekuensing multiregion. Nat. Med. 21, 751–759 (2015).

Ding, L. dkk. Evolusi klon pada leukemia myeloid akut yang kambuh diungkapkan oleh sekuensing seluruh genom Alam 481, 506–510 (2012).

Sequist, L. V. et al. Evolusi genotipik dan histologis kanker paru-paru memperoleh resistensi terhadap inhibitor EGFR. Sci. Terjemahan Med. 3, 75ra26 (2011).

Jamal-Hajani, M.et al. Melacak evolusi kanker paru-paru non-sel kecil. N. Inggris. J. Med. 376, 2109–2121 (2017).

Andor, N. dkk. Analisis pan-kanker dari tingkat dan konsekuensi dari heterogenitas intratumor. Nat. Med. 22, 105–113 (2016).

Mroz, E.A. dkk. Heterogenitas genetik intratumor yang tinggi berhubungan dengan hasil yang lebih buruk pada pasien dengan karsinoma sel skuamosa kepala dan leher. Kanker 119, 3034–3042 (2013).

Parker, W. T., Ho, M., Scott, H. S., Hughes, T. P. & amp Branford, S. Respon yang buruk terhadap inhibitor kinase lini kedua pada pasien leukemia myeloid kronis dengan beberapa mutasi tingkat rendah, terlepas dari profil resistensi mereka. Darah 119, 2234–2238 (2012).

Landau, D.A. dkk. Evolusi dan dampak mutasi subklonal pada leukemia limfositik kronis. Sel 152, 714–726 (2013).

Klco, J. M. et al. Hubungan antara pembersihan mutasi setelah terapi induksi dan hasil pada leukemia myeloid akut. JAMA 314, 811–822 (2015).

Misal, S. et al. Munculnya mutasi KRAS dan resistensi yang didapat terhadap terapi anti-EGFR pada kanker kolorektal. Alam 486, 532–536 (2012).

Stroun, M., Anker, P., Lyautey, J., Lederrey, C. & amp Maurice, P. A. Isolasi dan karakterisasi DNA dari plasma pasien kanker. Eur. J. Klinik Kanker. Onkol. 23, 707–712 (1987).

Bettegowda, C. dkk. Deteksi DNA tumor yang bersirkulasi pada keganasan manusia tahap awal dan akhir. Sci. Terjemahan Med. 6, 224ra24 (2014).

Wan, J.C.M. dkk. Biopsi cair datang dari usia: menuju implementasi DNA tumor yang bersirkulasi. Nat. Pdt. Kanker 17, 223–238 (2017).

Murtaza, M.et al. Analisis non-invasif dari resistensi yang didapat terhadap terapi kanker dengan sekuensing DNA plasma. Alam 497, 108–112 (2013).

Garcia-Murillas, I. et al. Pelacakan mutasi dalam DNA tumor yang bersirkulasi memprediksi kekambuhan pada kanker payudara dini Sci. Terjemahan Med. 7, 302ra133 (2015).

Tie, J. et al. Analisis DNA tumor yang beredar mendeteksi penyakit residual minimal dan memprediksi kekambuhan pada pasien dengan kanker usus besar stadium II. Sci. Terjemahan Med. 8, 346ra92 (2016).

Newman, A.M.et al. Metode ultrasensitif untuk menghitung DNA tumor yang bersirkulasi dengan cakupan pasien yang luas. Nat. Med. 20, 548–554 (2014).

Fujii, T. dkk. Pengurutan generasi berikutnya pengayaan mutasi untuk deteksi kuantitatif mutasi KRAS dalam DNA bebas sel urin dari pasien dengan kanker stadium lanjut. klinik Kanker Res. 23, 3657–3666 (2017).

Wang, Y.et al. Deteksi DNA yang diturunkan tumor dalam cairan serebrospinal pasien dengan tumor primer otak dan sumsum tulang belakang. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 112, 9704–9709 (2015).

Kinde, I.et al. Evaluasi DNA dari tes Papanicolaou untuk mendeteksi kanker ovarium dan endometrium. Sci. Terjemahan Med. 5, 167ra4 (2013).

Maritschnegg, E. dkk. Lavage rongga rahim untuk deteksi molekuler karsinoma duktus Müllerian: studi bukti konsep. J.klin. Onkol. 33, 4293–4300 (2015).

Wang, Y.et al. Deteksi mutasi somatik dan HPV dalam air liur dan plasma pasien dengan karsinoma sel skuamosa kepala dan leher. Sci. Terjemahan Med. 7, 293ra104 (2015).

Sidransky, D. dkk. Identifikasi mutasi onkogen ras pada tinja pasien dengan tumor kolorektal yang dapat disembuhkan. Sains 256, 102–105 (1992).

Aravanis, A. M., Lee, M. & Klausner, R. D.Urutan generasi berikutnya dari DNA tumor yang bersirkulasi untuk deteksi dini kanker. Sel 168, 571–574 (2017).

Armitage, P. & Doll, R. Distribusi usia kanker dan teori multi-tahap karsinogenesis. sdr. J. Kanker 8, 1–12 (1954).

Genovese, G. et al. Hematopoiesis klonal dan risiko kanker darah disimpulkan dari urutan DNA darah. N. Inggris. J. Med. 371, 2477–2487 (2014).

Jaiswal, S.et al. Hematopoiesis klon terkait usia terkait dengan hasil yang merugikan. N. Inggris. J. Med. 371, 2488–2498 (2014).

Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M. & amp Druley, T. E. Clonal haematopoiesis yang menyimpan mutasi terkait AML ada di mana-mana pada orang dewasa yang sehat. Nat. komuni. 7, 12484 (2016). Deskripsi penggunaan teknik koreksi kesalahan berbasis tag untai tunggal untuk mengidentifikasi klon preneoplastik di hampir semua orang dewasa, yang hanya 2 tahun sebelumnya diyakini terjadi hanya pada sebagian individu yang sangat tua. Ini adalah contoh penting tentang bagaimana pemahaman biologis mendasar dapat berubah dengan cepat dengan teknologi penemuan yang ditingkatkan.

Krimmel, J. D. et al. Sekuensing ultra-dalam mendeteksi sel kanker ovarium dalam cairan peritoneum dan mengungkapkan mutasi TP53 somatik pada jaringan non-kanker. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 113, 6005–6010 (2016).

Salk, J. J. et al. Duplex Sequencing mendeteksi mutasi terkait kanker yang muncul selama penuaan normal: evolusi klon selama satu abad kehidupan manusia [abstrak]. Kanker Res. 77, 3041 (2017).

Jee, J. dkk. Tingkat dan mekanisme mutagenesis bakteri dari sekuensing kedalaman maksimum. Alam 534, 693–696 (2016).

Maslov, A. Y., Quispe-Tintaya, W., Gorbacheva, T., White, R. R. & Vijg, J. Urutan throughput tinggi dalam deteksi mutasi: generasi baru tes genotoksisitas? mutasi. Res. 776, 136–143 (2015).

Fielden, M. R. et al. Memodernisasi penilaian risiko kanker manusia dari terapi. Tren Pharmacol. Sci. https://doi.org/10.1016/j.tips.2017.11.005 (2017).

Kim, D., Kim, S., Kim, S., Park, J. & Kim, J.-S. Spesifisitas target seluruh genom dari nuklease CRISPR-Cas9 diungkapkan oleh multipleks Digenome-seq. Res. Genom 26, 406–415 (2016).

Caperton, L. et al. Teknologi reproduksi berbantuan tidak mengubah frekuensi atau spektrum mutasi. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 104, 5085–5090 (2007).

Nelson, J. L. Keberbedaan diri: microchimerism dalam kesehatan dan penyakit. Tren Imunol. 33, 421–427 (2012).

Eun, J. K., Guthrie, K. A., Zirpoli, G. & amp Gadi, V. K. Kanker payudara in situ dan microchimerism. Sci. Reputasi. 3, 2192 (2013).

Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L. & amp Quake, S. R. Diagnosis noninvasif aneuploidi janin dengan senapan sekuensing DNA dari darah ibu. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 105, 16266–16271 (2008).

Chiu, R.W.K. dkk. Penilaian prenatal non-invasif dari trisomi 21 dengan sekuensing DNA plasma ibu multipleks: studi validitas skala besar. BMJ 342, c7401 (2011).

Bianchi, D.W. dkk. Tes prenatal noninvasif dan deteksi insidental dari keganasan ibu yang tersembunyi. JAMA 314, 162–169 (2015).

Jamuar, S. S. & Walsh, C. A. Mutasi somatik pada malformasi kortikal serebral. N. Inggris. J. Med. 371, 2038–2038 (2014).

Poduri, A., Evrony, G. D., Cai, X. & Walsh, C. A. Mutasi somatik, variasi genomik, dan penyakit neurologis. Sains 341, 1237758–1237758 (2013).

De Vlaminck, I.et al. DNA bebas sel yang beredar memungkinkan diagnosis penolakan transplantasi jantung noninvasif. Sci. Terjemahan Med. 6, 241ra77 (2014).

Shugay, M.et al. Menuju pembuatan profil repertoar imun yang bebas kesalahan. Nat. Metode 11, 653–655 (2014).

DeWitt, W.S. dkk. Dinamika respons sel T sitotoksik terhadap model infeksi virus akut. J. Viral. 89, 4517–4526 (2015).

Hsu, M.S. dkk. Pengurutan TCR dapat mengidentifikasi dan melacak sel T yang menginfiltrasi glioma setelah vaksinasi DC. Imunol Kanker. Res. 4, 412–418 (2016).

Tumeh, P.C. dkk. Blokade PD-1 menginduksi respons dengan menghambat resistensi imun adaptif. Alam 515, 568–571 (2014).

Goodnow, C. C. Patogenesis multilangkah penyakit autoimun. Sel 130, 25–35 (2007).

Qian, J.et al. Penambah super sel B dan kluster pengatur merekrut aktivitas tumorigenik AID Sel 159, 1524–1537 (2014).

Konsorsium Proyek Mikrobioma Manusia. Struktur, fungsi dan keragaman mikrobioma manusia yang sehat. Alam 486, 207–214 (2012).

Lynch, S. V. & Pedersen, O. Mikrobioma usus manusia dalam kesehatan dan penyakit. N. Inggris. J. Med. 375, 2369–2379 (2016).

Van de Wiele, T., Van Praet, J. T., Marzorati, M., Drennan, M. B. & amp Elewaut, D. Bagaimana mikrobiota membentuk penyakit rematik. Nat. Pdt. Rheumatol. 12, 398–411 (2016).

Rosenbaum, M., Knight, R. & Leibel, R. L. Mikrobiota usus dalam homeostasis energi manusia dan obesitas. Tren Endokrinol. Meta 26, 493–501 (2015).

Alexander, J. L. et al. Modulasi mikrobiota usus dari kemanjuran dan toksisitas kemoterapi. Nat. Pdt. Gastroenterol. Hepatol. 1805, 105 (2017).

Vindigni, S. M. & Surawicz, C. M. Transplantasi mikrobiota tinja. Gastroenterol. klinik Am Utara 46, 171–185 (2017).

Dominguez-Bello, M. G. et al. Restorasi sebagian mikrobiota bayi lahir sesar melalui transfer mikroba vagina. Nat. Med. 22, 250–253 (2016).

Roach, D.J. dkk. Setahun infeksi di unit perawatan intensif: sekuensing seluruh genom prospektif dari isolat klinis bakteri mengungkapkan transmisi samar dan mikrobiota baru. PLOS Gen. 11, e1005413 (2015).

Cummings, L.A. et al. Sekuensing generasi berikutnya klinis mengungguli kultur mikrobiologi standar untuk mengkarakterisasi sampel polimikroba. klinik Kimia 62, 1465–1473 (2016).

Grumaz, S. dkk. Diagnostik sekuensing generasi berikutnya dari bakteremia pada pasien septik. Obat Genom. 8, 73 (2016).

Kim, S.et al. Persiapan sampel mikrofluida otomatis dengan throughput tinggi untuk genomik mikroba yang akurat. Nat. komuni. 8, 13919 (2017).

Acevedo, A., Brodsky, L. & Andino, R. Lanskap mutasi dan kebugaran virus RNA terungkap melalui pengurutan populasi. Alam 505, 686–690 (2014).

Eigen, M. Konsep quasispecies sebentar lagi akan berusia 50 tahun. Pengantar. Curr. Atas. Mikrobiol. kekebalan. 392, vii (2016).

Henn, M. R. dkk. Sekuensing seluruh genom HIV-1 mengungkapkan dampak varian minor awal pada pengenalan kekebalan selama infeksi akut. PLOS Pathog. 8, e1002529 (2012).

Solmone, M.et al. Penggunaan pyrosequencing ultradeep paralel masif untuk mengkarakterisasi keragaman genetik virus hepatitis B pada pasien yang resistan terhadap obat dan naif obat dan untuk mendeteksi varian minor pada reverse transcriptase dan antigen hepatitis B. J. Viral. 83, 1718–1726 (2009).

Svarovskaia, E. S., Martin, R., McHutchison, J. G., Miller, M. D. & amp Mo, H. Banyak mutan NS3 yang resistan terhadap obat terdeteksi oleh sekuensing mendalam pada pasien yang terinfeksi virus hepatitis C yang menjalani monoterapi NS3 protease inhibitor. J.klin. Mikrobiol. 50, 3267–3274 (2012).

Daum, L.T. dkk. Urutan torrent ion generasi berikutnya dari mutasi resistensi obat di Mycobacterium tuberculosis ketegangan. J.klin. Mikrobiol. 50, 3831–3837 (2012).

Katz, M., Hover, B. & Brady, S. Penemuan budaya-independen produk alami dari metagenom tanah. J.Ind. Mikrobiol. Bioteknologi. 43, 129–141 (2016).

Bassil, N. M., Bryan, N. & amp Lloyd, J. R. Degradasi mikroba asam isosakarinat pada pH tinggi. ISME J. 9, 310–320 (2015).

Yamamoto, S.et al. Metabarcoding DNA lingkungan mengungkapkan komunitas ikan lokal di laut pesisir yang kaya spesies. Sci. Reputasi. 7, 40368 (2017).

Mayo, B.et al. Dampak teknik sekuensing generasi berikutnya dalam mikrobiologi makanan. Curr. Genom. 15, 293–309 (2014).

Jäger, A.C. et al. Validasi pengembangan Sistem Genomik Forensik MiSeq FGx untuk pengurutan generasi berikutnya yang ditargetkan dalam pekerjaan kasus DNA forensik dan laboratorium basis data. Ilmu Forensik. Int. gen. 28, 52–70 (2017).

Stiller, M.et al. Pola kesalahan penggabungan nukleotida selama amplifikasi enzimatik dan pengurutan langsung skala besar DNA purba. Prok. Natl Acad. Sci. Amerika Serikat 103, 13578–13584 (2006).

Avery, O. T., Macleod, C. M. & McCarty, M. Studi tentang sifat kimia zat yang menginduksi transformasi jenis pneumokokus: induksi transformasi oleh fraksi asam desoksiribonukleat yang diisolasi dari pneumokokus tipe III. J. Eks. Med. 79, 137–158 (1944).

Lander, E. S. et al. Sekuensing awal dan analisis genom manusia. Alam 409, 860–921 (2001).

Mostovoy, Y. et al. Pendekatan hibrida untuk perakitan dan pentahapan urutan genom manusia de novo. Nat. Metode 13, 587–590 (2016).

Bickhart, D.M. dkk. Pengurutan molekul tunggal dan penangkapan konformasi kromatin memungkinkan perakitan referensi de novo genom kambing domestik. Nat. gen. 49, 643–650 (2017).

Raja, D.A. dkk. Variasi struktural mosaik pada anak-anak dengan gangguan perkembangan. Bersenandung. Mol gen. 24, 2733–2745 (2015).

Navin, N. dkk. Evolusi tumor disimpulkan oleh sekuensing sel tunggal. Alam 472, 90–94 (2011).

Vitak, S.A. dkk. Mengurutkan ribuan genom sel tunggal dengan pengindeksan kombinatorial. Nat. Metode 14, 302–308 (2017).

Zheng, G.X.Y. dkk. Profil transkripsi digital paralel besar-besaran dari sel tunggal. Nat. komuni. 8, 14049 (2017).

Rosenberg, A.B. dkk. Penskalaan transkriptomik sel tunggal melalui pengkodean kumpulan kumpulan terpisah. Pracetak di bioRxiv https://doi.org/10.1101/105163 (2017).

Ullal, A.V. dkk. Pembuatan profil sel kanker dengan kode batang memungkinkan analisis protein multipleks dalam aspirasi jarum halus. Sci. Terjemahan Med. 6, 219ra9 (2014).

Konsorsium Proyek ENCODE. Ensiklopedia terintegrasi elemen DNA dalam genom manusia. Alam 489, 57–74 (2012).

Sun, W.-J. dkk. RMBase: sumber daya untuk mendekode lanskap modifikasi RNA dari data sekuensing throughput tinggi. Asam Nukleat Res. 44, D259–265 (2016).

Koleksi Selamat Datang. Charles Robert Darwin. Foto oleh L. Darwin. selamat datang kepercayaan https://wellcomecollection.org/works/s6x9wbsj?page=1&query=darwin (2016).


Hasil

SCP dan implementasinya ke dalam alur kerja genotipe sel tunggal

Prinsip SCP asli telah dijelaskan sebelumnya secara rinci [15]. Gambar 1A–1C menunjukkan prototipe SCP yang kami gunakan untuk penelitian ini dan alur kerja untuk isolasi dan analisis sel tunggal dalam format 384-sumur: Pertama, suspensi sel dipipet ke dalam kartrid sekali pakai yang terdiri dari bagian plastik yang digiling dan chip dispenser mikofluida (Gbr 1A). Selanjutnya, kartrid dipasang pada kepala cetak yang terdiri dari aktuator piezo yang menggerakkan chip dispenser (Gbr 1B). Sistem penglihatan mikroskopis memantau nosel chip dispenser dan menyediakan data gambar untuk deteksi, klasifikasi, dan isolasi sel (lihat di bawah). Tetesan yang tidak diinginkan dibuang melalui sistem rana vakum. Kepala cetak dipasang pada tahap robot tiga sumbu yang memungkinkan deposisi yang tepat dari tetesan enkapsulasi sel tunggal ke dalam sumur mikro yang ditentukan dalam perangkat lunak SCP oleh operator. Berbeda dari aplikasi sebelumnya, dalam penelitian ini, SCP digunakan untuk isolasi sel kanker dan lisis sel berikutnya, WGA dan analisis genetik molekuler (Gambar 1D).

(A) Suspensi sel diisi ke dalam kartrid sekali pakai yang steril. (B) Dudukan pelat microwell dilengkapi dengan kamera untuk secara otomatis menentukan dan menyesuaikan offset dispenser sebelum pencetakan sel (kompensasi offset otomatis, AOC). Dispenser dengan kartrid terpasang dan optik pendeteksi sel adalah bagian dari kepala cetak. (C) Tampilan total dari prototipe SCP yang digunakan dalam penelitian ini. (D) Ilustrasi alur kerja untuk genotipe sel tunggal. Sel individu diisolasi melalui SCP. Setelah lisis sel, DNA mengalami amplifikasi seluruh genom (WGA), yang kemudian dapat digunakan untuk analisis genetik molekuler rutin.

Evaluasi presisi dan efisiensi deposisi sel tunggal

Prasyarat untuk analisis genetik adalah deposisi yang tepat dari sel tunggal di dalam sumur, karena hanya dengan demikian lisis sel dan WGA dapat dilakukan dengan andal, mengingat volume reaksi yang kecil.

Meskipun presisi dispenser cukup tinggi untuk menyimpan tetesan enkapsulasi sel tunggal ke dalam sumur mikro, kami mengamati bahwa posisi tetesan di dalam sumur dapat bervariasi. Penyebabnya adalah perbedaan posisi nozzle karena proses fabrikasi cartridge dan fiksasi cartridge ke printhead. Untuk mendepositkan tetesan secara akurat ke dasar sumur secara otomatis, kami merancang alat untuk mengkompensasi offset tersebut dengan mengukur posisi penempatan tetesan sebelum dan selama proses isolasi sel. Untuk ini, tetesan dikeluarkan pada slide kaca yang dicitrakan oleh kamera digital yang terpasang pada plateholder microwell (Gbr 2). Posisi tetesan diekstraksi dari data gambar dan algoritme secara otomatis menghitung posisi pengeluaran yang benar untuk menargetkan pusat sumur mikro.

(A) Untuk ini, tetesan dikeluarkan pada slide kaca yang dicitrakan oleh kamera digital. (B) Posisi droplet sebenarnya diekstraksi dari data citra dengan pengolahan citra dengan openCV. (C) menampilkan gambar biner setelah thresholding. Algoritme secara otomatis menghitung posisi pengeluaran yang benar untuk menargetkan pusat sumur mikro.

Selain itu, tetesan yang terbang bebas dapat dibelokkan oleh gaya elektrostatik, yang terjadi karena muatan listrik yang terakumulasi pada tetesan dan pelat. Jadi, kami menggunakan udara terionisasi untuk menetralkan pengisian elektrostatik pelat sumur mikro.

Untuk mengevaluasi apakah SCP dengan kompensasi offset pengeluaran otomatis dan deionisasi menyimpan tetesan tunggal dengan efisiensi dan presisi tinggi, manik-manik lateks fluoresen hijau berukuran 10 m tunggal sebagai ekuivalen sel dicetak ke dalam lubang pelat sumur mikro 384, dan ejeksi dan efisiensi deposisi dinilai. Efisiensi ejeksi (yaitu benar-benar satu manik telah dikeluarkan dari nozzle) ditentukan melalui gambar yang disimpan secara otomatis oleh SCP yang menunjukkan nozzle sebelum, selama, dan setelah dispensasi (Gbr 3A–3E). Efisiensi deposisi (yaitu satu manik berhasil dikirim ke dasar sumur) disimpulkan dari gambar mikroskop fluoresensi (Gbr 3F).

Empat gambar berurutan disimpan secara otomatis untuk setiap aktivitas pencetakan: (A-C) Sebuah sel (atau manik sebagai sel yang setara) diangkut menuju nosel dari chip dispenser, di mana ia terdeteksi dan diklasifikasikan dalam wilayah yang diinginkan (ROI, area hijau). Hanya jika pengenalan objek memenuhi kriteria yang telah ditentukan dalam hal ukuran, kebulatan dan singularitas, tetesan yang dikeluarkan dari nosel akan ditargetkan ke sumur. (D) Gambar akhir mengkonfirmasi tidak adanya sel di nosel setelah pengeluaran tetesan. Seri gambar dapat digunakan untuk memberikan bukti langsung bahwa benar-benar satu sel dikeluarkan. (E) menunjukkan contoh untuk gambar di mana dua sel akan memasuki tetesan. Tetesan tersebut secara otomatis dibuang oleh hisap vakum. Untuk mengevaluasi ketepatan instrumen, 2304 manik-manik fluoresen tunggal dicetak ke dalam enam pelat 384-microwell. Gambar dievaluasi untuk menentukan efisiensi ejeksi (99,7%). (F) Manik-manik yang disimpan dengan benar (lingkaran putus-putus) divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi dari dasar sumur (diameter 1,2 mm). (G) Manik-manik dikirim dengan benar dalam rata-rata 98,8% sumur jika pelat sumur mikro dinetralkan secara elektrostatis sebelum dicetak.

Dari manik-manik fluoresen, 1152 masing-masing dibagikan ke dalam tiga pelat 384-sumur yang tidak diberi perlakuan atau tiga deionisasi, ini sama dengan jumlah total 2304 manik-manik. Efisiensi ejeksi manik tunggal secara keseluruhan rata-rata 99,7 ± 0,3%. Efisiensi deposisi tergantung pada apakah pelat dideionisasi atau tidak. Tanpa deionisasi sebelumnya, hanya dalam 20,7 ± 8,4% dasar sumur, satu manik terdeteksi, sedangkan setelah deionisasi 98,8 ± 1,5% manik terkirim dengan benar (Gbr 3G).

Mengikuti alur kerja ini, total 150 sel tunggal dari asal yang berbeda (U-2 OS, n = 40 Kasumi-1, n = 44 pasien AML, n = 66) dicetak ke dalam pelat 384 sumur deionisasi yang menghasilkan total single- efisiensi ejeksi sel sebesar 98,7%. Subset dari sel yang dicetak dari setiap spesimen menjadi sasaran WGA dan genotipe (seperti yang dijelaskan di bawah).

Amplifikasi genom seluruh sel tunggal

Sel tunggal menjadi sasaran WGA sebelum analisis molekuler hilir. Untuk meminimalkan kemungkinan kontaminasi DNA yang akan diamplifikasi bersama oleh WGA, kami bekerja dengan kartrid dan pelat bebas DNA dan mengurangi langkah-langkah langsung selama isolasi, lisis, dan amplifikasi sel. Keberhasilan WGA dinilai dengan kuantisasi fluorometrik DNA, dan PCR pada pengulangan LINE1 transposon digunakan untuk mengontrol amplifikasi DNA manusia dalam sampel dan ketidakhadirannya dalam kontrol tanpa templat.

Dari 40 sel U-2 OS yang disimpan ke dalam sumur mikro terdeionisasi, 25 menjadi sasaran WGA yang menghasilkan hasil DNA rata-rata 3,8 g (kisaran, 3,5–5,5 g) per sel (Gambar 4A) PCR pada LINE1 transposon positif pada semua sampel (Gambar 4B). Dari Kasumi-1, 33 sel menjadi sasaran WGA, menghasilkan hasil DNA rata-rata 14,3 g (kisaran, 8,6-20,8 g) per sel, dan LINE1 PCR positif di semua sel (S1 Gambar). Di antara 23 sel tunggal dari pasien AML, WGA menghasilkan hasil DNA rata-rata 16,3 g (kisaran, 14,0–19,3 g) per sel dan positif LINE1 PCR di semua sel (S2 Gambar).

(A) Diagram batang yang menampilkan hasil DNA WGA dari sel-sel OS U-2 individu dan kontrol masing-masing, yang diukur dengan Qubit ™ . (B) Gel agarose yang menggambarkan produk dengan ukuran berbeda dari LINE1 multipleks PCR yang dilakukan pada DNA WGA dari sel U-2 OS individu. (C) Kromatogram sekuensing contoh dari SLC34A2 dan TET2 mutasi gen dalam sel massal dan sel individu. (D) Kesimpulan terjadinya allelic dropout (ADO) melalui sekuensing single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNP rs1391438 dan rs7655890 terletak di dekat genomik dengan TET2 mutasi dan menunjukkan pola heterozigot dalam sel massal (kiri). Dalam sel tunggal U-2 OS B8 dan C10, tipe liar hanya terdeteksi di TET2 situs mutasi. Pola heterozigot dari SNP di B8 menunjukkan tipe liar yang sebenarnya di TET2, sedangkan deteksi hanya satu alel dari kedua SNP di C10 menunjukkan hilangnya wilayah genom karena ADO. NTC: kontrol tanpa template, PTC: kontrol positif.

Kami juga memeriksa apakah DNA mengambang bebas ada dalam tetesan yang dihasilkan oleh SCP. DNA tersebut, jika diperkuat oleh WGA, akan menghambat analisis genetik sel tunggal. Oleh karena itu, tetesan kosong (n = 1, 3, dan 10, masing-masing) dari suspensi sel Kasumi-1 dicetak ke dalam sumur individu dari pelat 384 sumur dan kemudian dikenai WGA. Semua tetesan kosong tidak menghasilkan produk berikutnya LINE1 PCR, sedangkan tetesan yang mengandung sel Kasumi-1 tunggal positif (Gambar S3).

Genotipe sel kanker tunggal

Kami berusaha untuk mengevaluasi penerapan SCP untuk isolasi dan analisis genetik sel kanker tunggal. Untuk ini, kami mempelajari varian gen representatif di U-2 OS, Kasumi-1 dan PBMC pasien dengan AML.

OS U-2 menyimpan mutasi di SLC34A2 (ENST00000382051: c.1538G>T p.R513L) dan TET2 gen (ENST00000380013: c.1394C>T p.P465L) [17], keduanya memiliki relevansi fungsional pada kanker [19-21]. Kami mengkonfirmasi mutasi di SLC34A2 dan TET2 dalam sampel massal. Sejalan dengan data yang dipublikasikan [17], kromatogram menyarankan bahwa SLC34A2 mutasi adalah homo atau hemizigot dan TET2 mutasi heterozigot.Dari data array CNV kami, kami menyimpulkan bahwa zigositas SLC34A2 mutasi itu karena hilangnya heterozigositas (LOH) dari wilayah genom masing-masing. Dalam 25 sel U-2 OS yang dianalisis, SLC34A2 mutasi terdeteksi pada 23 dan TET2 mutasi pada 19 sel (Gambar 4C dan 5A). Dalam satu sel, SLC34A2 PCR dan, di sel lain, keduanya SLC34A2 dan TET2 PCR berulang kali gagal, yang menunjukkan amplifikasi wilayah target yang tidak memadai oleh WGA. Seperti yang diharapkan dari zygositas dalam jumlah besar, tidak ada sel dengan SLC34A2 urutan tipe liar terdeteksi. Sebaliknya, TET2 urutan tipe liar hanya terdeteksi dalam 5 sel. Sel-sel ini dievaluasi untuk keberadaan ADO untuk memungkinkan kesimpulan mengenai terjadinya mutasi pada sel individu (lihat di bawah).

(A) Garis sel OS U-2, (B) Garis sel Kasumi-1 dan (C) pasien LMA. Ditampilkan adalah nukleotida yang diidentifikasi dengan pengurutan spesimen curah dan sel individu (diberi keterangan misalnya B1 atau C1). Disorot dengan warna merah adalah adanya dan dalam warna hijau tidak adanya urutan mutasi masing-masing. Yang disorot dalam warna abu-abu adalah analisis yang tidak meyakinkan baik karena PCR yang gagal (n.d., tidak ditentukan) atau kemungkinan terjadinya dropout alelik (*). Untuk analisis mutasi gen, arsitektur klon yang disimpulkan dari analisis sel tunggal ditampilkan secara skematis.

Kasumi-1 menyimpan mutasi pada tirosin kinase KIT (ENST00000288135: c.2466T>A p.N822K) dan penekan tumor TP53 (ENST00000269305: c.743G>A p.R248Q) [17]. Mutasi pada KIT dan TP53 dikonfirmasi oleh NGS dalam sampel massal Kasumi-1. Sebagaimana diverifikasi oleh pyrosequencing, VAF dari KIT mutasi adalah 84,0% pada median (kisaran, 83,3-85,2%). Representasi berlebihan dari alel yang bermutasi disebabkan oleh amplifikasi KIT wilayah genomik [22,23]. NS TP53 mutasi hadir dengan VAF 100% sejalan dengan LOH dari wilayah kromosom 17p dalam susunan CNV. NS KIT mutasi terdeteksi pada 30 dan TP53 mutasi pada 25 sel (Gambar 5B). Di sel yang tersisa, KIT atau TP53 PCR gagal, kemungkinan besar karena amplifikasi yang tidak efisien dari masing-masing wilayah oleh WGA. Tidak ada sel dengan KIT atau TP53 hanya urutan tipe liar yang terdeteksi. Berkenaan dengan terjadinya mutasi, analisis menghasilkan hasil yang informatif untuk kedua mutasi dalam 23 sel. Semua sel ini menyimpan baik KIT dan TP53 mutasi (Gambar 5B).

Dalam PBMC pasien dengan AML, kami menilai SNP non-sinonim rs1042522 yang berpotensi patogen di TP53 (ENST00000269305: c.215C>G p.P72R) [24,25]. Kami memutuskan untuk pendekatan ini karena tidak ada alel-C yang terdeteksi oleh sekuensing Sanger dari spesimen massal dan karena, seperti yang ditunjukkan oleh susunan FISH dan CNV, AML menyimpan satu atau lebih klon dengan hilangnya alel kromosom 17p (termasuk TP53 S4 Gambar), dan hilangnya kromosom TP53 pada kanker secara istimewa mempengaruhi alel-C dari rs1042522 [25]. Jadi, kami menguji apakah alel C leluhur masih dapat dideteksi dalam subset sel individu. Memang, TP53 PCR menghasilkan produk dalam 21 sel, 5 di antaranya alel C terdeteksi (Gambar 5C).

Evaluasi dropout alelik dan terjadinya mutasi pada U-2 OS

Sebagaimana dinyatakan di atas, dalam 5 sel OS U-2 TET2 hanya urutan tipe liar yang terdeteksi. Untuk mengevaluasi apakah tidak adanya TET2 mutasi dalam sel-sel ini disebabkan oleh ADO, kami menganalisis SNP rs1391438 dan rs7655890 (terletak 4.650 bp dan 15.992 bp 5 'dari TET2 mutasi, masing-masing) dalam sel-sel ini, kedua SNP adalah heterozigot dalam sampel massal (Gambar 4C). Di salah satu dari 5 sel, hanya satu dari dua alel dari setiap SNP yang terdeteksi, yang sangat menunjukkan bahwa ADO telah terjadi di wilayah genom yang mencakup SNP dan TET2 mutasi (Gambar 4C). Jadi, kami menganggap analisis sel yang satu ini tidak meyakinkan. Dalam 4 sel yang tersisa, kedua SNP adalah heterozigot, menunjukkan bahwa WGA telah berhasil mengamplifikasi kedua alel (Gambar 4C) ini membuatnya tidak mungkin bahwa tidak adanya sel TET2 mutasi pada sel-sel ini disebabkan oleh ADO. Dengan demikian, kami menyimpulkan bahwa 4 sel ini memang tidak memiliki TET2 mutasi.

Jadi, dalam hal kejadian bersama, analisis kami menghasilkan hasil yang informatif untuk kedua situs mutasi dalam 22 sel. Dari jumlah tersebut, 18 sel menyimpan keduanya SLC34A2 dan TET2 mutasi sementara 4 menyimpan SLC34A2 tapi bukan TET2 mutasi, yang menunjukkan heterogenitas klon sehubungan dengan TET2 sel bermutasi dalam garis sel U-2 OS (Gambar 5A).

Di Kasumi-1, tidak diperlukan evaluasi ADO karena tidak ada sel dengan KIT atau TP53 hanya urutan tipe liar yang terdeteksi.


Memecahkan Masalah Data Anda

Dua penyebab paling umum kegagalan untuk mendapatkan data urutan yang baik atau apa pun untuk sampel Anda adalah kemurnian dan konsentrasi DNA templat Anda. Jika Anda mengalami kesulitan mendapatkan hasil pengurutan yang baik untuk sampel Anda, Anda mungkin ingin melihat melalui bagian Dasar Pengurutan kami untuk beberapa rekomendasi tentang persiapan template dan kuantisasi. Jika tampaknya Anda telah melakukan semuanya dengan benar dan mengikuti saran kami, lihat di bawah untuk beberapa alasan tambahan mengapa Anda mungkin mendapatkan kualitas data urutan DNA yang kurang optimal.

Tidak Ada Data Urutan

Menyebabkan: situs priming tidak ada
Solusi: jika Anda telah memilih salah satu primer vektor fasilitas pengurutan, pastikan itu ada di vektor Anda. Sementara banyak primer yang kami sediakan cukup umum untuk banyak vektor yang berbeda (misalnya T7, M13-48R), yang lain khusus untuk satu jenis tertentu (misalnya, GL primer 1 dapat digunakan dengan vektor pGL2 tetapi tidak dengan vektor pGL3). Periksa kembali peta/urutan plasmid Anda.

- Jika Anda telah mendesain primer kustom Anda sendiri dari data urutan sebelumnya, pastikan Anda menggunakan area urutan yang andal - cari puncak yang tajam dan terdefinisi dengan baik tanpa ambiguitas. Hindari area di mana puncak lebih lebar dan tidak terpisah dengan baik - ini akan terjadi menjelang akhir urutan di mana fragmen lebih besar dan polimer tidak dapat menyelesaikan nukleotida tunggal secara memadai, menyebabkan pemanggilan basa yang tidak akurat.

Menyebabkan: Tidak cukup atau tidak ada DNA/primer dalam tabung
Solusi: Periksa ulang kuantitas, konsentrasi stok, dan pengenceran Anda. Periksa kami Jenis DNA apa yang dapat kita urutkan dan berapa banyak yang kita butuhkan? bagian untuk memastikan Anda telah memberikan jumlah DNA dan/atau primer yang sesuai. Sementara pengurutan kami sangat sensitif dan dapat mendeteksi kisaran konsentrasi DNA, masih ada jumlah "ambang" yang harus dicapai untuk mendapatkan data sekuens apa pun.

Menyebabkan: Kontaminan penghambat
Solusi: Reaksi pengurutan siklus yang digunakan untuk memperkuat sampel untuk pengurutan otomatis sangat sensitif terhadap keberadaan kontaminan tertentu, beberapa di antaranya akan sepenuhnya menghambat enzim pengurutan kami. Silakan periksa bagan Kontaminan di NS Persiapan dan pemurnian template bagian untuk daftar inhibitor potensial dan jumlah yang dapat ditoleransi. Anda mungkin perlu membuat ulang sampel Anda untuk menghapus satu atau lebih komponen penghambat secara memadai untuk mendapatkan data urutan apa pun.

Menyebabkan: Reagen kedaluwarsa
Solusi: Reagen tidak dapat kedaluwarsa

Data Bising dengan Sinyal Lemah

Data "berisik" dapat diidentifikasi dengan adanya beberapa puncak dan banyak "N" dalam urutan Anda. Program Analisis Sekuensing menetapkan "N' sebagai identifikasi dasar ketika ada dua atau lebih puncak yang ada pada satu posisi. "N" ini dapat menandakan kejadian yang sah dari dua nukleotida, seperti dalam kasus heterozigot, tetapi mungkin juga terlihat saat kebisingan latar belakang tinggi atau saat ada beberapa produk. Saat sampel Anda menunjukkan sinyal yang lemah, perangkat lunak berupaya mengimbanginya dengan menaikkan sinyal pita sampel ke tingkat yang dapat dideteksi. Namun, kebisingan latar belakang juga akan diperkuat secara artifisial, memberikan rasio signal-to-noise yang buruk. Noise latar belakang muncul sebanyak puncak yang lebih kecil dan tidak terdefinisi di bawah puncak urutan yang Anda minati. Noise ini selalu ada, tetapi dengan sampel yang disiapkan dengan baik dari kekuatan sinyal yang baik, itu tidak akan terdeteksi. Untuk menentukan apakah Anda data berisik mungkin karena sinyal lemah, lihat file jejak ABI Anda. Jika Anda melihat kromatogram kertas, lihat ke arah atas dan tengah jejak Anda untuk menemukan garis yang bertuliskan "Sinyal". Jika file berada di y komputer kami, klik tombol radio "A" di sudut kiri bawah, yang terlihat saat Anda membuka file jejak dalam program tampilan, seperti EditView atau Chromas. Gulir ke bawah ke baris yang bertuliskan "Sinyal" dan Anda akan melihat empat nukleotida diikuti dengan angka dalam tanda kurung. Angka-angka ini mewakili kekuatan sinyal rata-rata setiap nukleotida dan nilainya harus, secara optimal, antara 200-400. Jika mereka jauh kurang dari 100, maka Anda dapat menganggap data bising Anda setidaknya sebagian karena sinyalnya yang lemah.

Menyebabkan: Tidak cukup DNA
Solusi: Periksa kembali kuantitas, konsentrasi stok, perhitungan, dan pengenceran Anda. Periksa kami Jenis DNA apa yang dapat kita urutkan dan berapa banyak yang kita butuhkan? bagian untuk memastikan Anda telah memberikan jumlah DNA dan/atau primer yang sesuai.

Menyebabkan: Kontaminan penghambat misalnya garam, fenol
Solusi: Reaksi pengurutan siklus yang digunakan untuk memperkuat sampel untuk pengurutan otomatis sangat sensitif terhadap keberadaan kontaminan tertentu, beberapa di antaranya dapat menghambat sebagian atau seluruhnya enzim pengurutan kami. Silakan periksa bagan Kontaminan di Persiapan dan pemurnian template bagian untuk daftar inhibitor potensial dan jumlah yang dapat ditoleransi. Anda mungkin perlu memurnikan ulang sampel Anda untuk menghilangkan satu atau lebih komponen penghambat secara memadai guna mendapatkan data urutan yang lebih baik.

Menyebabkan: DNA terdegradasi dari nuklease, pembekuan-pencairan berulang, paparan sinar UV berlebihan, pengobatan bisulfit.
Solusi: Kontaminasi nuklease dalam preparasi template serta siklus beku-cair berulang dapat menurunkan DNA dari waktu ke waktu. Bahkan jumlah nuklease yang rendah dapat secara ekstensif mendegradasi DNA tergantung pada kondisi penyimpanan dan suhu, serta lamanya waktu DNA disimpan. Umumnya, isolasi ulang dan pemurnian DNA template akan diperlukan untuk mendapatkan urutan DNA yang baik. Saat mengekstrak produk PCR dari gel, paparan sinar UV yang terlalu lama akan menurunkan dan merusak DNA. Batasi waktu dan intensitas UV sebanyak mungkin untuk mencegah degradasi. Ketika merawat DNA dengan bisulfit untuk percobaan metilasi, penting untuk menghindari inkubasi yang lama pada suhu yang lebih tinggi karena sejumlah besar DNA akan terdegradasi dalam proses ini.

Penyebab: Tmerusak data yang memburuk?
Solusi: Jika sebelumnya Anda dapat memperoleh data urutan yang baik tetapi mulai melihat penurunan kualitas yang semakin memburuk, Anda mungkin memiliki beberapa kontaminasi dalam satu atau lebih reagen, atau memiliki beberapa reagen yang telah mencapai akhir kegunaannya. Buat stok segar dari reagen yang biasa digunakan, seperti buffer, dan selalu gunakan air suling berkualitas tinggi dalam persiapan Anda.

Karena akupengikatan primer yang tidak efisien (Tm rendah, primer yang merosot, ketidakcocokan)
Solusi: Tm primer didefinisikan sebagai suhu di mana 50% oligonukleotida dan komplemen sempurnanya berada dalam dupleks. Tm oligo dapat dihitung secara kasar dengan menggunakan rumus:

Ini adalah rumus yang paling umum digunakan untuk menghitung Tm, meskipun ini bukan yang paling akurat karena tidak memperhitungkan konsentrasi garam atau formamida. Situs web yang bagus untuk dilihat jika Anda tertarik dengan beberapa teori terperinci di balik perhitungan Tm adalah http://www.sigma-genosys.com/oligo_meltingtemp.asp.

Dalam reaksi pengurutan siklus kami, langkah anil primer/templat kami terjadi pada 50ºC. Jadi, jika Tm primer Anda jauh lebih rendah dari 50ºC, hibridisasi ke templat komplementernya akan jauh lebih tidak efisien dan lebih sedikit fragmen yang diperluas akan dihasilkan. Tingkatkan Tm primer Anda dengan menambahkan basa tambahan ke ujung 5' atau 3' untuk menaikkan Tm agar berada dalam kisaran 52ºC-58ºC. Primer yang mengalami degenerasi dan basa yang tidak cocok juga akan menunjukkan penurunan efisiensi hibridisasi karena pengurangan stabilitas pengikatan primer, dan jika degenerasi atau ketidakcocokan terjadi pada atau dekat ujung 3' primer Anda, kemungkinan besar upaya pengurutan Anda akan gagal. .

Beberapa Puncak Dalam Urutan Anda

Kehadiran beberapa puncak dalam urutan Anda dapat disebabkan oleh banyak faktor. Untuk membantu menentukan penyebabnya, akan berguna untuk melihat dua aspek - di mana beberapa puncak dimulai, serta kekuatan sinyal keseluruhan sampel Anda. Seperti disebutkan di atas dalam bagian data Noisy dengan sinyal lemah, sampel dengan kekuatan sinyal rendah dapat memiliki noise latar belakang artifisial tinggi yang dapat memberikan tampilan beberapa puncak. Namun, jika angka kekuatan sinyal rata-rata Anda di atas 100 atau lebih, kemungkinan gangguan latar belakang tidak akan menjadi masalah eksklusif Anda. Kami telah memecah bagian ini menjadi dua bagian, berdasarkan di mana beberapa puncak Anda dimulai.

Dari awal

Menyebabkan: Beberapa situs priming yang melibatkan vektor
Larutan: Primer Anda mungkin memiliki situs hibridisasi sekunder yang mungkin identik atau terkait erat, dengan urutan nukleotida yang berbeda mengikuti setiap situs, memberikan pita yang ditumpangkan dalam urutan Anda. Jika situs priming identik, (seperti ketika lebih dari satu situs promotor T7 hadir, misalnya), puncak ganda akan kuat sejak awal. Fragmen juga dapat menunjukkan migrasi bergeser sehingga puncak ganda tidak langsung di atas satu sama lain tetapi akan diimbangi ke satu sisi atau yang lain karena pola mobilitas yang berbeda dari untaian dengan komposisi nukleotida yang berbeda. Dalam kasus lain, situs priming sekunder mungkin tidak persis sama, tetapi mungkin berbeda dengan beberapa pangkalan internal. Dalam hal ini, primer yang tidak cocok mungkin tidak berhibridisasi seefisien mungkin tetapi masih dapat menyatu dan memanjang, dan menimbulkan fragmen yang kurang intens yang dapat dilihat di bawah puncak minat Anda. Dalam kedua kasus, Anda perlu menyaring vektor dan menyisipkannya dengan hati-hati untuk mencari urutan yang mungkin cocok atau mirip dengan primer yang Anda usulkan. Anda mungkin perlu memilih primer vektor lain di ujung yang sama dari beberapa situs kloning atau mendesain ulang primer kustom Anda. Ketika memilih primer lain sulit, seperti ketika primer berjalan melalui area yang berulang, cobalah untuk menemukan primer yang memiliki kecocokan basis 3' khusus untuk area yang Anda minati yang dapat membantu bertindak sebagai "jangkar".

Menyebabkan: Beberapa situs priming di PCR
Larutan: Hal ini dapat terjadi ketika satu atau kedua primer PCR berhibridisasi ke lebih dari satu posisi pada DNA template, sehingga menimbulkan beberapa produk PCR. Seringkali ini akan terlihat jelas ketika memvisualisasikan produk PCR pada gel agarosa karena akan ada lebih dari satu pita. Dalam hal ini, pemurnian gel dari produk yang diinginkan akan diperlukan. Akan tetapi, seseorang dapat mengalami kesulitan, ketika produknya sangat mirip dalam ukuran, yang mungkin timbul ketika mengamplifikasi DNA yang terkait atau berulang, dan tidak terpisah dengan baik pada gel. Dalam hal ini, optimasi reaksi PCR mungkin diperlukan atau desain ulang primer PCR untuk memilih situs priming yang lebih spesifik.

Menyebabkan: Primer PCR bertindak sebagai maju dan mundur
Larutan: Kadang-kadang, produk PCR dapat dihasilkan ketika satu primer berfungsi sebagai primer maju dan mundur dalam reaksi PCR, sehingga menghasilkan produk artifaktual. Hal ini cukup mudah dideteksi ketika mengurutkan produk PCR karena satu primer akan memberikan puncak ganda sejak awal, sementara yang lain gagal memberikan data urutan apa pun. Desain ulang set primer PCR Anda.

Menyebabkan: Primer PCR sisa dan/atau dNTPs
Larutan: Karena dua primer hadir dalam reaksi PCR, penghilangan primer yang tidak lengkap dapat menyebabkan puncak ganda dalam data sekuensing. Kedua primer akan bertindak sebagai primer sekuensing dan mengarah ke pita yang ditumpangkan yang sesuai dengan untai komplementer dari orientasi yang berlawanan. Sangat penting untuk menghilangkan kelebihan primer dan dNTP dari reaksi PCR dengan pemurnian (lihat kami Persiapan dan pemurnian template bagian untuk rekomendasi kami tentang pemurnian PCR). Jika mencoba melakukan pengurutan langsung produk PCR tanpa pemurnian dengan mengencerkan alikuot produk PCR Anda dengan air untuk menurunkan konsentrasi primer residu dan dNTPS (metode yang tidak kami rekomendasikan), maka sangat penting untuk mengoptimalkan reaksi PCR Anda sehingga bahwa primer dan dNTPS digunakan dalam jumlah terbatas sehingga sebagian besar digunakan pada akhir PCR.

Menyebabkan: Primer dengan Tm . tinggi
Larutan: Primer yang memiliki Tm jauh lebih tinggi (>65ºC) daripada yang kami sarankan 52ºC-58ºC sering tidak berfungsi dengan baik sebagai primer pengurutan. Ketika primer memiliki Tm yang tinggi, seringkali akibat peningkatan kandungan G-C atau karena primer cukup panjang, kedua faktor tersebut dapat meningkatkan potensi pembentukan struktur sekunder primer. Jika memungkinkan, pilih primer lain dengan Tm yang lebih rendah. Jika itu tidak optimal, beri tahu kami dan kami dapat melakukan metode pengurutan siklus dua langkah yang menghilangkan langkah anil suhu 50ºC terendah dan melanjutkan dari langkah denaturasi 96ºC ke langkah ekstensi 60ºC. Langkah 60ºC, dalam hal ini, akan berfungsi sebagai langkah anil dan ekstensi. Ini terkadang dapat meningkatkan hasil pengurutan.

Menyebabkan: Primer dengan n-1 populasi

Larutan: Masalah ini tidak jarang dan dapat dihasilkan dari sintesis primer sekuensing berkualitas buruk. Primer disintesis dari ujung 3 ke ujung 5 dan ketika sintesis tidak efisien, akan ada populasi yang signifikan kurang dari primer full-length - n-1s, yang merupakan primer full-length dikurangi satu basa, ditambah lainnya yang lebih pendek derivatif. Primer-primer ini memiliki 3'end yang sama tetapi 5'ends yang berbeda, sehingga rantai yang berakhir pada posisi yang sama akan memiliki panjang yang berbeda dan akan berjalan pada posisi yang berbeda pada gel. Primer yang telah terdegradasi dari 3'end juga akan memberikan tampilan ini. Sangat mudah untuk menemukan masalah ini dalam kromatogram sekuensing karena setiap posisi akan berisi puncak yang sebenarnya serta puncak yang berada tepat di sebelah kanannya, memberikan tampilan puncak "bayangan". Apapun penyebab n-1s, primer perlu disintesis ulang untuk mendapatkan oligo dengan kualitas yang sesuai untuk pengurutan. Ketika reagen berkualitas tinggi dan protokol yang tepat digunakan selama sintesis oligo, pemurnian primer dengan kartrid atau HPLC biasanya tidak diperlukan untuk oligo biasa (<30 bp), tetapi terkadang pemurnian tambahan dapat bermanfaat.

Mulailah lebih jauh ke dalam urutan

Menyebabkan: Persiapan plasmid campuran
Larutan: Prep plasmid yang terkontaminasi oleh lebih dari satu produk, seperti dua vektor dengan sisipan yang berbeda atau vektor dengan sisipan dan vektor tanpa, umumnya akan menunjukkan bagian awal dari data urutan bersih (urutan situs kloning ganda vektor umum) diikuti oleh puncak ganda.Kadang-kadang, plasmid mungkin mengandung lebih dari satu molekul vektor atau mungkin mengalami delesi atau insersi spontan selama pertumbuhan. Titik di mana puncak ganda dimulai sesuai dengan awal situs kloning sisipan. Untuk menghindari masalah ini, penting untuk hati-hati memilih satu koloni dari piring pertumbuhan Anda, restreaking jika perlu, untuk memastikan bahwa koloni Anda benar-benar klon. Anda harus menindaklanjuti ini dengan intisari pembatasan plasmid Anda yang habis pada gel agarosa untuk memastikan vektor dan sisipan ada seperti yang diharapkan.

Menyebabkan: Daerah homopolimer

Larutan: Daerah yang mengandung bentangan panjang nukleotida tunggal bisa sulit untuk diurutkan secara akurat. Peregangan pendek daerah homopolimer umumnya tidak sulit untuk dilalui, tetapi bagian yang lebih panjang dapat menjadi tantangan. Data urutan hingga dan termasuk wilayah polinukleotida mungkin baik-baik saja, tetapi basis terakhir dari wilayah poli dan semua puncak yang mengikutinya mungkin menunjukkan pola puncak ganda seperti gelombang yang tidak dapat ditafsirkan. Hal ini cenderung lebih bermasalah pada produk PCR, tetapi juga dapat terjadi saat mengurutkan plasmid, terutama saat mencoba mengurutkan wilayah poliA dari cDNA. Kesulitan ini diduga timbul karena enzim “selip” ketika untai yang tumbuh tidak tetap berpasangan dengan benar dengan DNA cetakan selama polimerisasi melalui daerah homopolimer, sehingga menimbulkan fragmen dengan panjang yang bervariasi yang memiliki urutan yang sama setelah daerah ini. Saat mengurutkan DNA kloning dengan wilayah homopolimer, beberapa opsi dapat dicoba. Dalam kimia sekuensing BigDye Terminator kami, dTTP telah diganti dengan dUTP, yang menurunkan suhu leleh DNA. Namun, ini juga memiliki efek meningkatkan kecenderungan selip yang terjadi melalui daerah poliT (di mana A berada di untai templat). Kimia sekuensing alternatif dapat digunakan - kimia dRhodamin - di mana dTTP masih dalam reaksi, dan umumnya memberikan hasil yang lebih baik melalui daerah poliA ini. Sebagai alternatif, primer oligo dT(12-15) yang mengandung dasar goyangan (A, G atau C) pada ujung 3’ dapat digunakan untuk menambatkan primer pada tempatnya di ujung daerah poliA dan memberikan urutan bersih berikut. Mengurutkan untaian yang berlawanan terkadang bisa lebih berhasil, terutama saat melewati wilayah poliG karena untaian poliC sering kali lebih mudah untuk dilewati. Terkadang merancang primer baru yang lebih dekat ke wilayah homopolimer dapat membantu, karena konsentrasi nukleotida dan aktivitas enzim akan berada dalam kisaran yang lebih optimal ketika memperluas fragmen yang lebih kecil dalam reaksi sekuensing siklus. Dan terakhir, kami dapat mencoba menyesuaikan kondisi pengurutan siklus kami karena suhu anil yang lebih tinggi dan waktu perpanjangan yang lebih lama terkadang dapat berguna dalam kasus seperti ini. Pendekatan serupa dapat digunakan ketika mencoba untuk mengurutkan produk PCR dengan daerah homopolimer, tetapi, pada akhirnya, terkadang perlu untuk mengkloning produk PCR untuk membaca peregangan berulang.

Menyebabkan: Kompresi
Larutan: Kompresi kadang-kadang dapat diamati ketika suatu wilayah struktur sekunder terbentuk dalam untai DNA yang diamplifikasi, yang menyebabkan perubahan dalam mobilitas elektroforesis untai DNA. Ini dapat muncul sebagai fragmen yang tumpang tindih setelah titik tertentu dan dapat menyerupai persiapan plasmid yang terkontaminasi, tetapi persiapan yang terkontaminasi akan menunjukkan puncak ganda yang dimulai di tempat penyisipan. Untuk mengendurkan kompresi ini, terkadang kita dapat mengubah kondisi pengurutan siklus atau menggunakan aditif untuk mengubah sifat struktur sekunder. Atau, Anda dapat membuat linearisasi DNA Anda atau menggunakan 7-deaza-dGTP dalam reaksi PCR untuk membantu meringankan kompresi.

Menyebabkan: Mutasi pergeseran bingkai
Larutan: Mutasi pergeseran bingkai dapat terjadi ketika satu atau lebih basa dimasukkan atau dihapus ke dalam DNA templat dan jika ada banyak produk dalam sampel Anda, apakah itu DNA plasmid atau produk PCR, Anda akan melihat urutan yang bersih hingga titik mutasi. , diikuti oleh puncak ganda yang disebabkan oleh pergeseran urutan nukleotida. Dalam kasus DNA plasmid, Anda perlu mengisolasi ulang DNA Anda untuk mendapatkan klon murni yang hanya mengandung satu molekul. Dengan produk PCR, Anda perlu memurnikan kedua produk dengan gel untuk memisahkannya.

Urutan terpotong

Urutan terpotong dapat dicirikan sebagai tiba-tiba atau bertahap. Pemotongan tiba-tiba akan menunjukkan sinyal yang kuat dan bersih hingga suatu titik dan kemudian turun tajam selama beberapa nukleotida hingga sinyal yang jauh lebih lemah atau tidak terdeteksi. Pemotongan bertahap akan menunjukkan data urutan yang baik pada awalnya tetapi kemudian mulai berkurang ke puncak yang semakin lemah dan lebih kecil hingga tidak ada apa-apa selain kebisingan latar belakang. Sifat pemotongan terkadang dapat membantu menentukan penyebabnya.

Menyebabkan: Struktur sekunder


Menyebabkan: DNA linier
Larutan: Jika DNA Anda telah dipotong dengan satu atau lebih enzim restriksi, data urutan akan berakhir dengan tajam di tempat pengenalan enzim yang dipotong di ujung 3' sisipan Anda. Apakah Anda secara tidak sengaja mengirimi kami DNA yang dicerna? Jalankan pada gel untuk melihat.

Menyebabkan: Terlalu banyak DNA


Larutan: Meskipun ada kisaran konsentrasi DNA yang dapat kita urutkan dengan andal, terlalu banyak DNA akan menyebabkan penghentian sinyal secara dini. Overloading DNA akan menunjukkan puncak top-heavy awal diikuti oleh tinggi dan kekuatan puncak yang melemah dengan cepat. Ini terjadi karena dNTPS dalam reaksi sekuensing siklus akan didistribusikan di antara terlalu banyak rantai yang diperpanjang dan akan habis lebih awal, menghasilkan jumlah fragmen pendek yang berlebihan. Kelebihan beban menjadi perhatian khusus saat mengurutkan pada sistem kapiler 3100 kami karena sistem ini jauh lebih sensitif terhadap konsentrasi DNA dan kurang toleran terhadap kelebihan beban DNA dan kelebihan beban yang parah akan mengurangi masa pakai susunan kapiler (sangat mahal) kami. Selain itu, jika template Anda tidak murni, konsentrasi DNA yang lebih tinggi dapat disertai dengan jumlah kontaminan yang lebih tinggi yang selanjutnya dapat memperburuk kualitas urutan DNA Anda. Jadi tolong hitung DNA template Anda dengan hati-hati dan periksa Metode untuk bagian kuantisasi untuk rekomendasi kami.

Menyebabkan: garam
Larutan: Jumlah garam yang berlebihan juga akan menyebabkan penghentian prematur dan mungkin terlihat mirip dengan kelebihan beban DNA, dengan sinyal yang kuat diikuti oleh sinyal yang semakin melemah. Garam memiliki efek penghambatan pada proses sekuensing Taq polimerase, yang dapat menyebabkan kelebihan fragmen pendek, atau jika konsentrasi garam terlalu besar, enzim akan sepenuhnya dihambat tanpa data urutan yang diperoleh. Jika garam berpotensi menjadi masalah, lakukan pengendapan etanol untuk menghilangkan garam.

Menyebabkan: Daerah berulang

Larutan: Komposisi nukleotida, serta ukuran, daerah berulang dapat memainkan peran besar dalam keberhasilan pengurutan melalui daerah tersebut. Secara umum, pengulangan GC dan GT (sering terlihat pada DNA yang diberi perlakuan bisulfit) cenderung menjadi yang paling merepotkan meskipun, seperti yang disebutkan sebelumnya, versi terbaru dari Applied Biosystems BigDye Terminator v3.1 berisi beberapa modifikasi yang memungkinkan beberapa peningkatan mencolok dalam template tertentu yang sebelumnya sulit. Namun, masih ada beberapa yang tetap sakit. Secara umum, seseorang dapat mengurutkan sebagian melalui wilayah berulang dan sinyal mulai memudar dan akhirnya menjadi tidak terbaca. Ini mungkin karena penipisan dNTP prematur, pembentukan struktur sekunder atau selip enzim. Berbagai metode dapat dicoba untuk mengurutkan pengulangan seluruhnya, dan banyak yang serupa dengan yang akan kita gunakan untuk template kaya G-C yang membentuk struktur sekunder, termasuk penambahan betaine atau DMSO dan/atau perubahan parameter pengurutan siklus. Jika daerah pengulangan tidak terlalu besar, pengurutan dari untai yang berlawanan untuk melengkapi daerah dapat berhasil, terutama jika untai komplementer memiliki komposisi nukleotida yang diperpanjang secara lebih efisien. Namun, jika wilayahnya besar, mungkin sulit untuk menyelesaikan seluruh urutannya dan menentukan jumlah pengulangan yang ada. Metode alternatif, seperti penghapusan terarah atau penggunaan sistem transposon in vitro mungkin perlu digunakan.

Sequencing Artefak

Pasti ada hubungan antara persiapan template dan sejauh mana artefak ini bisa menjadi masalah, jadi semakin bersih dan lebih akurat jumlah sampel Anda, semakin sedikit masalah artefak ini. Sampel bersih dengan sinyal kuat umumnya tidak terpengaruh oleh artefak ini, dan jika demikian, berkali-kali puncak sebenarnya dapat diidentifikasi dan dikoreksi. Kami secara visual memeriksa setiap kromatogram dan mengedit apa yang kami bisa. Tetapi ketika kami menemukan artefak yang mungkin disebabkan oleh masalah pembersihan instrumen atau pasca-siklus, dan kami tidak dapat memastikan basecalling yang benar, dan sampel Anda memiliki kekuatan sinyal yang baik dan tidak ada masalah nyata lainnya, kami akan mengulanginya. sampel, ATAS PERMINTAAN, tanpa biaya. Kami meminta Anda memeriksa kromatogram Anda juga dan jika ada artefak pengurutan yang menyebabkan kesulitan dengan analisis Anda, dan memenuhi kriteria di atas, harap beri tahu kami segera dan kami akan menjalankan kembali sampel sesegera mungkin. Kami menyimpan sampel yang bereaksi selama beberapa hari (DNA dan primer selama 2-3 bulan) tetapi kemudian membuangnya, jadi beri tahu kami secepat mungkin jika Anda ingin mengulanginya.

Artefak: "Gumpalan pewarna"

Larutan: Gumpalan pewarna adalah molekul terminator pewarna tidak tergabung yang telah melewati kolom pembersihan dan tetap berada dalam larutan dengan DNA murni yang dimuat ke dalam sequencer. Mereka paling sering terlihat dengan sampel yang memiliki kekuatan sinyal rendah. Sampel dengan sinyal lemah biasanya 1). Tidak memiliki cukup DNA sehingga ada lebih sedikit template awal untuk diamplifikasi dan diberi label, sehingga meninggalkan proporsi molekul pewarna yang tidak tergabung atau 2). mengandung kontaminan yang menghambat reaksi sekuensing dan berteori bahwa kontaminan tertentu mungkin memiliki kecenderungan untuk mengikat gumpalan pewarna ini. Dan kami telah memperhatikan pola di mana sampel pelanggan tertentu, secara keseluruhan, lebih cenderung mengandung gumpalan pewarna terlepas dari kekuatan sinyalnya. Secara umum, gumpalan pewarna muncul sebagai puncak yang luas dan tidak terdefinisi dari satu atau dua warna (biasanya merah dan biru pada 3100 data) dengan puncak DNA sebenarnya di bawahnya, dan cenderung muncul relatif awal pada data - umumnya sebelum 50-60 bp - jadi bagi banyak orang, mereka tidak terlalu menjadi masalah karena itu masih urutan vektor. Pengulangan sampel dengan gumpalan pewarna umumnya tidak terlalu berhasil, karena tidak sering hilang tetapi terkadang menjadi kurang intens. Dengan sampel yang sangat lemah, seringkali tidak banyak yang dapat kami lakukan untuk memperbaiki data. Dengan sampel kekuatan sinyal rata-rata, bagaimanapun, mereka biasanya mudah diperbaiki karena puncak yang sebenarnya sering terlihat di bawah.

Artefak: "Sepatu berduri"

Larutan: "Paku" terlihat sebagai puncak warna-warni dalam urutan yang biasanya mengaburkan hanya satu atau dua data senilai nukleotida, dan terjadi pada sampel yang dijalankan pada sekuenser berbasis kapiler seperti 3100. Mereka disebabkan oleh gelembung udara kecil di dalam polimer cair atau dengan potongan-potongan kecil polimer kering yang terkelupas dan masuk ke dalam kapiler. Sekali lagi, tampaknya ada sedikit kecenderungan bagi beberapa sampel pelanggan untuk mengalami artefak ini dan, ketika itu terjadi, jauh lebih jelas pada sampel dengan sinyal lemah. Ketika sampel memiliki sinyal yang kuat, mereka seringkali tidak dapat dideteksi, tetapi ada kalanya mereka bisa sangat terlihat. Hal yang baik adalah bahwa ini paling sering selalu dapat diperbaiki saat dijalankan kembali. Jadi, beri tahu kami jika Anda ingin pengulangan karena lonjakan - bagi Anda yang hanya tertarik pada wilayah kecil yang terpisah yang tidak terpengaruh oleh hal seperti ini, tidak perlu menjalankan ulang, tetapi bagi mereka yang mencari di seluruh kerangka baca, misalnya, kami menyadari bahwa ini akan menjadi masalah. Jadi, karena kami tidak dapat mengetahui eksperimen dan wilayah minat semua orang, kami meminta Anda membantu kami dan memberi tahu kami ketika masalah ini memengaruhi analisis Anda dan kami akan segera mengulanginya untuk Anda.

Artefak: Hilangnya resolusi

Larutan: Sampel yang menunjukkan hilangnya resolusi (atau LOR) pada awalnya akan menunjukkan puncak yang tajam dan terdefinisi dengan baik yang, setelah beberapa waktu, mulai melebar dan semakin menurun kualitasnya ke titik di mana puncak lebar ini menjadi tidak dapat dibaca. Terjadinya masalah ini terkadang terkait dengan instrumen dan di lain waktu mungkin terkait sampel. Ketika penyebabnya terkait dengan instrumen, biasanya karena pengisian kapiler yang tidak tepat saat polimer baru dipompa melalui susunan. Dengan memodifikasi parameter dalam perangkat lunak yang menyebabkan pengisian kapiler menjadi lebih lambat dan lebih lengkap, kami dapat secara dramatis mengurangi kejadian LOR. Ketika masalahnya terkait dengan sampel, hal itu dianggap karena kontaminan (saat ini) yang tidak diketahui. Ada spekulasi bahwa kontaminan ini lebih mungkin ada ketika kolom yang tersedia di beberapa kit persiapan mini komersial kelebihan beban. Karena biasanya sulit untuk menentukan penyebab pasti LOR sporadis, kami secara otomatis menjalankan kembali sampel yang menunjukkan LOR dan, hampir selalu, sampel akan berjalan dengan baik untuk kedua kalinya.

Daerah Homopolimer

- Lihat diskusi tentang homopolimer di atas di bawah Beberapa puncak dalam urutan Anda, wilayah homopolimer.

Pangkalan Hilang/Ekstra

Saat Anda menganalisis data urutan dan tampaknya satu atau lebih basa telah dimasukkan atau dihapus, hal pertama yang harus selalu Anda lakukan adalah memeriksa kromatogram Anda secara visual. Seringkali, ambiguitas ini disebabkan oleh analisis perangkat lunak yang salah dari puncak dan biasanya akan terjadi baik di awal urutan atau jauh lebih lambat ketika resolusi fragmen besar kurang optimal. Masalah analisis biasanya mudah diperbaiki. Baca kami Menafsirkan kromatogram Anda bagian pertama untuk ikhtisar dasar tentang cara cepat mengevaluasi jejak dan memahami kualitas keseluruhannya. Kemudian lihat di bawah untuk beberapa contoh masalah perangkat lunak yang lebih spesifik, serta beberapa situasi yang kurang umum di mana nukleotida mungkin benar-benar hilang atau dimasukkan.

Menyebabkan: Kesulitan memanggil dasar
Larutan: Seperti disebutkan di atas, perangkat lunak Analisis Sekuensing kami tidak selalu 100% akurat saat menetapkan penunjukan dasar, dan kesalahan ini paling sering terjadi baik sangat awal dalam urutan - 50 bp pertama atau lebih - serta jauh kemudian dalam urutan, untuk urutan yang berbeda. alasan. Di awal urutan, fragmen terkecil menunjukkan beberapa variabilitas kecil dalam migrasi yang dapat membuang perhitungan yang digunakan perangkat lunak untuk menyesuaikan jarak puncak yang tepat, dengan kombinasi nukleotida tertentu lebih rentan daripada yang lain. Seperti disebutkan sebelumnya, kami secara visual memeriksa semua file jejak dan kami akan secara manual mengedit perubahan yang kami temukan, dan sebagian besar sangat mudah untuk diperbaiki. Pengeditan manual kami akan muncul sebagai huruf kecil dalam urutan. Namun, kami selalu SANGAT menyarankan ANDA juga memeriksa file kromatogram Anda untuk memeriksa ulang data urutan. Apa yang kami cari, sejak awal, adalah puncak-puncak yang bermigrasi sangat berdekatan dengan celah jarak yang mungkin terjadi di kedua sisi. Dalam kasus seperti ini, komputer dapat memasukkan "N" untuk mengkompensasi jarak puncak yang aneh, meskipun sebenarnya tidak ada nukleotida di sana. Sebagai alternatif, ketika ada celah spasi seperti ini, perangkat lunak dapat menafsirkan sedikit peningkatan kebisingan latar belakang sebagai puncak dan secara keliru memasukkan basis tambahan di tempat yang seharusnya tidak ada. Kadang-kadang ketika puncak sangat berdekatan, ada juga kecenderungan perangkat lunak untuk melewatkan salah satu dari mereka sepenuhnya dan meninggalkan satu nukleotida dari urutan. Dan terakhir, beberapa molekul pewarna tak tergabung yang berlebih akan bermigrasi pada posisi yang sama dengan basa pertama dari urutan Anda, terkadang mengaburkan 10-20 basa pertama. Selain itu, fragmen terkecil tidak selalu diselesaikan dengan sangat tajam, masalah yang tampaknya lebih menonjol pada sequencer berbasis kapiler. Untuk semua alasan yang disebutkan di atas, selalu yang terbaik untuk memilih primer yang berjarak setidaknya 40-50 basis dari urutan minat Anda sehingga Anda dapat yakin bahwa Anda berada di wilayah dengan akurasi tertinggi. Kombinasi nukleotida tertentu lebih cenderung menunjukkan migrasi ganjil pada 40-50 bp pertama dan terkadang bercampur atau tidak terpisah dengan baik. Periksa kembali data urutan di mana C diikuti oleh A, di mana A diikuti oleh G dan di mana ada dua atau tiga A berturut-turut.

Anda juga mungkin menemukan bahwa kemunculan basa tambahan atau hilang menjadi lebih sering menjelang akhir urutan. Ada batasan pada daya pisah polimer untuk memisahkan fragmen terbesar sehingga sementara intensitas sinyal pita selanjutnya mungkin masih cukup kuat, puncaknya akan menjadi lebih lebar dan kurang tajam. Versi terbaru perangkat lunak Analisis Sekuensing mencakup algoritme yang ditingkatkan yang memungkinkan interpretasi yang lebih baik dari jarak fragmen yang lebih besar ini, dan telah menunjukkan peningkatan akurasi pemanggilan dasar lebih jauh, tetapi masih ada batasnya. Dengan menggunakan protokol POP-7 yang dimodifikasi dan larik 50cm pada 3100-an, kami sering mendapatkan basis 900-950, dan seringkali lebih, dengan akurasi >98% pada dipersiapkan dengan baik template.

Menyebabkan: Primer mutagenesis yang diarahkan situs
Larutan: Saat membuat primer DNA, sintesis oligo berlangsung dari ujung 3’ ke ujung 5’. Selama prosedur sintesis, pemotongan dapat terjadi ketika basa spesifik gagal ditambahkan ke rantai oligo yang sedang tumbuh. Kimia sekuensing DNA umumnya memungkinkan sekuens kegagalan ini dibatasi dan tidak diperpanjang lebih jauh, tetapi proses ini tidak selalu 100% efisien dan beberapa pemotongan ini akan terus memanjang, dengan basis internal dihapus. Akibatnya, sintesis DNA yang lengkap akan berisi tidak hanya produk panjang penuh yang diinginkan, tetapi juga berpotensi menjadi populasi dari kombinasi semua urutan penghapusan basa tunggal internal yang mungkin. Pemurnian primer akan menghilangkan sebagian besar rangkaian kegagalan ini tetapi sebagian kecil dari pemotongan ini mungkin masih tersisa. Jadi, ketika menggunakan primer sintetis untuk mutagenesis terarah-situs, ada potensi untuk memilih klon yang mengandung oligo yang merupakan salah satu produk penghapusan ini dan bukan primer full-length Anda. Jika ini terjadi, Anda harus mencoba memilih beberapa klon lain untuk pengurutan, dan seringkali Anda akan menemukan satu yang mengandung primer mutagenesis yang diinginkan. Jika Anda menemukan klon Anda secara konsisten mengandung penghapusan yang sama di wilayah primer Anda, kesalahan mungkin telah terjadi saat memprogram urutan primer dan Anda harus menghubungi perusahaan sintesis untuk primer baru. Untuk primer mutagenesis yang diarahkan ke lokasi, selalu disarankan untuk memilih agar oligo Anda dimurnikan dengan HPLC untuk meminimalkan populasi urutan kegagalan.


Afiliasi

Departemen Biologi Molekuler Hewan, Institut Riset Nasional Produksi Ternak, Krakowska 1, Balice, 32-083, Kraków, Polandia

Klaudia Pawlina-Tyszko, Ewelina Semik-Gurgul, Artur Gurgul, Maria Oczkowicz & Tomasz Szmatoła

Pusat Pengobatan Eksperimental dan Inovatif, Universitas Pertanian di Kraków, Rędzina 1c, 30-248, Kraków, Polandia

Artur Gurgul & amp Tomasz Szmatoła

Departemen Reproduksi Hewan, Anatomi dan Genomik, Universitas Pertanian di Kraków, al. Mickiewicza 24/28, 30-059, Kraków, Polandia


Hasil

Kinerja NGS pada Sampel DNA dari Bahan Tetap Beku Segar dan Formalin

Urutan berjalan yang hanya berisi sampel FF menghasilkan pembacaan yang lebih bermanfaat secara signifikan (p = 0,0009), yang didefinisikan sebagai pembacaan yang melewati filter kualitas (Gbr 2A), meskipun perbedaan absolut dalam pembacaan yang dapat digunakan hanya 7,1%. Analisis statistik perpustakaan menunjukkan persentase pembacaan sesuai target yang meningkat secara signifikan (p = 0,002) untuk sampel FF dibandingkan dengan sampel FFPE (Gambar 2B), di mana jumlah sampel yang mengandung persentase pembacaan sesuai target yang rendah terbatas. Selain itu, sampel dengan persentase rendah sesuai target dan dengan demikian cakupan rendah dapat dengan mudah diidentifikasi: total 7,7% sampel dikeluarkan karena cakupan rata-rata <800x di mana 71% menunjukkan juga <80% sesuai target. Sampel yang dikecualikan ini terdiri dari 98% sampel FFPE. Parameter kualitas yang tersisa termasuk jumlah pembacaan yang dipetakan tidak menunjukkan perbedaan. Selain itu, semua wilayah yang ditargetkan dapat tercakup secara memadai, karena tidak ada amplikon yang menunjukkan cakupan rata-rata rata-rata di bawah 100x yang mengarah ke pengecualian dari analisis dan 87% amplikon untuk sampel FFPE dan 94% amplikon untuk sampel FF tercakup >800x rata-rata (S2 Gambar). Selama periode asupan 1,5 tahun penelitian ini, urutan berjalan dilakukan pada tingkat yang stabil (S3 Gambar), dengan hanya sedikit penurunan persentase bacaan yang dapat digunakan dan peningkatan persentase ISP berkualitas rendah dari saat inklusi sampel FFPE setengah jalan periode waktu ini.

A) Boxplot statistik run sampel FFPE (hijau) dan FF (oranye) untuk 4 variabel: 1. persentase kepadatan ISP (Ion Sphere Particle) (sumur yang dapat dialamatkan pada chip yang memiliki pemuatan terdeteksi) 2. pembacaan yang dapat digunakan jumlah pembacaan (persentase ISP yang lolos poliklonal, kualitas rendah, dan filter primer dimer) 3. poliklonal, ISP yang berisi lebih dari satu urutan template per ISP dan 4. kualitas rendah, ISP dengan sinyal rendah atau tidak dapat dikenali. "Engsel" atas dan bawah plot kotak sesuai dengan kuartil pertama dan ketiga (persentil ke-25 dan ke-75). “Kumis” atas memanjang dari engsel ke nilai tertinggi yaitu dalam 1,5*IQR dari garis, di mana IQR adalah rentang antar-kuartil (jarak antara kuartil pertama dan ketiga). "Kumis" bawah memanjang dari engsel ke nilai terendah dalam 1,5*IQR dari engsel. Data di luar akhir garis vertikal adalah outlier dan diplot sebagai titik. B) Statistik perpustakaan sampel FFPE (hijau) dan FF (oranye) rata-rata kedalaman baca basis target (termasuk basis target yang tidak tercakup) jumlah pembacaan yang dipetakan ke genom referensi lengkap dan persentase pembacaan yang dipetakan yang selaras dengan wilayah sasaran. Perbedaan signifikan yang dihitung dengan uji-t independen antara sampel FFPE dan FF digambarkan dengan ** p = 0,002 atau ***p = 0,0009).

Singkatnya, sampel berkualitas baik dapat dikenali dengan cakupan rata-rata setidaknya 800x dan >80% tepat sasaran.

Saat membandingkan cakupan semua amplikon di Ampliseq Cancer Hotspot Panel v2 antara sampel FFPE dan FF, penurunan cakupan untuk amplikon yang lebih panjang terlihat pada sampel FFPE (S4 Gambar). Juga tidak ada perbedaan yang signifikan dalam rasio transisi basa C & gt T atau G & gt A dalam sampel FFPE dibandingkan dengan sampel FF (Gambar S5).[27, 28]

Mendefinisikan Persyaratan untuk Pemanggilan Mutasi dalam Sampel DNA

Untuk menentukan batas deteksi varian uji, eksperimen pengenceran empat sampel DNA FF dengan diketahui TP53 mutasi dilakukan. Dengan R kuadrat dari 94,53% data pengenceran mendekati frekuensi alel yang diharapkan (garis pas, S6 Gambar). Yang diketahui TP53 mutasi terdeteksi dengan andal hingga frekuensi alel 1%. Karena uji pengenceran dapat melebih-lebihkan sensitivitas uji, maka batas frekuensi alel 5% ditetapkan agar dapat diandalkan untuk penggunaan diagnostik di masa mendatang.

Karena persentase sel tumor yang ada dalam bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA merupakan variabel penting yang menentukan kemampuan pengujian apa pun untuk mendeteksi mutasi somatik pada spesimen diagnostik, [29] kami memperkirakan bahwa varian dapat dideteksi ketika setidaknya 20 pembacaan terdeteksi. dengan cakupan 800x untuk amplikon, mengingat bahan masukan mengandung minimal 10% sel tumor (Gambar 3). Untuk panggilan mutasi standar, 800x mungkin tidak diperlukan tetapi pengujian kami dirancang untuk mendapatkan sensitivitas tinggi bahkan untuk sampel dengan persentase sel tumor rendah. Selanjutnya, kami melakukan analisis pada seluruh dataset untuk menilai apakah persentase sel tumor dari bahan input mempengaruhi VAF rata-rata. Secara teoritis, mutasi heterozigot dalam sampel diploid dengan 10% sel tumor dapat dideteksi dengan andal saat menggunakan batas deteksi frekuensi 5%, tetapi kami tidak menemukan hubungan antara persentase tumor dan VAR (Gambar 4).

Garis menggambarkan cakupan yang dibutuhkan untuk persentase tumor tertentu. Dalam penelitian ini, batas deteksi 20 varian digunakan, yang dikombinasikan dengan persentase tumor minimal 10%, menghasilkan cakupan yang dibutuhkan 800x.

Frekuensi alel yang diamati untuk semua varian yang terdeteksi menggunakan NGS diplot terhadap persentase sel tumor yang ditentukan oleh ahli patologi. Garis hijau menggambarkan garis teoritis frekuensi alel yang diharapkan dari mutasi heterozigot (somatik) versus persentase sel tumor. Garis regresi linier paksa (garis hitam) diplot untuk menentukan apakah peningkatan persentase tumor mempengaruhi frekuensi alel rata-rata yang terdeteksi dengan koefisien korelasi 0,041.

Validasi Profil Mutasi yang Diperoleh dengan Uji Ampliseq

Kami memvalidasi 328 varian, 323 di antaranya sesuai antara NGS dan teknik konvensional, menghasilkan kesesuaian keseluruhan 98,5% (sensitivitas 99,1%) (Gambar 5, Tabel 1). Dari 5 sampel sumbang, dua varian negatif palsu dari TP53 exon 8 (p.G266E) diidentifikasi menggunakan Sanger Sequencing tetapi tidak menggunakan NGS, perbedaan yang tidak dapat diselesaikan. Varian negatif palsu ketiga diidentifikasi dalam TP53 exon 7 (c.757_758insA, p.T253fs*11) yang tidak dipanggil oleh TVC tetapi terlihat jelas di IGV. Satu-satunya varian positif palsu adalah TP53, exon 7 (c.723delC, p.C242fs*5) yang dipanggil oleh TVC tetapi tidak terlihat di IGV setelah pemeriksaan manual. Varian sumbang terakhir diidentifikasi dalam EGFR exon 21 (p.L858R) dengan VAF 7,3% yang tidak terdeteksi menggunakan analisis HRM karena persentase sel tumor yang rendah dari bahan input (diperkirakan 5-10%). TP53 tidak sepenuhnya tercakup dalam panel Ampliseq menghasilkan 19 sampel di mana a TP53 varian diidentifikasi dengan Sanger Sequencing, yang tidak dapat diidentifikasi menggunakan NGS (Tabel S4). Data ini mendukung kesimpulan bahwa alur kerja Ion Torrent AmpliSeq adalah teknik yang andal untuk analisis mutasi dan pemeriksaan manual di IGV yang semakin meningkatkan keandalannya.

A) Jumlah absolut sampel dengan mutasi pada berbagai gen seperti yang ditunjukkan pada sumbu x yang digunakan untuk validasi NGS melalui platform Ion Torrent. Semua sampel diberi kode warna: biru tua adalah sampel yang sesuai dengan mutasi yang sama dalam standar versus NGS, biru antara adalah sampel yang sesuai yang tidak menunjukkan mutasi, bilah biru muda mewakili sampel yang tidak selaras B) Data yang sama seperti yang digambarkan pada Gambar 5A , namun direpresentasikan sebagai persentase dari semua sampel yang diuji untuk gen tertentu.

Interpretasi Data yang Diperoleh dengan Uji Ampliseq

Untuk memahami lebih lanjut apakah hasil NGS mencerminkan pola mutasi yang diharapkan, kami menganalisis semua mutasi yang diidentifikasi dalam TP53, KRAS, BRAF, EGFR dan PIK3CA gen dalam dataset akhir yang berisi 386 sampel, 290 berasal dari bahan FF dan 96 berasal dari bahan FFPE. Meskipun panel AmpliSeq tidak mencakup keseluruhan TP53 gen, mutasi diidentifikasi di seluruh wilayah yang ditargetkan (Gambar 6A). Perbandingan dengan database TCGA menunjukkan 82% tumpang tindih temuan kami dibandingkan dengan database TCGA (S8 Gambar). Seperti yang bisa diharapkan, distribusi mutasi terbatas diidentifikasi untuk KRAS, BRAF, EGFR dan PIK3CA (Gambar 6B–6E) karena gen ini mengandung lokasi hotspot mutasi, yang dapat dideteksi dengan andal dalam pengujian ini. Yang menarik, beberapa bagian dari PIK3CA gen diurutkan tanpa mengidentifikasi mutasi, menunjukkan tidak adanya bias sistematis terhadap temuan positif palsu berdasarkan pilihan amplikon yang diurutkan.

Semua grafik menggambarkan plot lolipop (diadaptasi dari (Vohra dan Biggin, 2013)) menunjukkan varian yang diidentifikasi relatif terhadap representasi skematis dari gen. Setiap posisi dengan mutasi memperoleh lingkaran, panjang garis tergantung pada jumlah mutasi yang terdeteksi pada kodon itu. Bar abu-abu mewakili seluruh protein dengan posisi asam amino yang berbeda (aa). Kotak berwarna adalah domain fungsional tertentu. Di atas lolipop varian yang paling sering dijelaskan sebagai perubahan asam amino di situs tertentu. Garis hitam di bawah kotak abu-abu menunjukkan daerah di mana panel Ampliseq menutupi gen. A) Mutasi yang diidentifikasi dalam TP53 gen menggunakan NGS, B) KRAS, C) BRAF, D) EGFR dan E) PIK3CA.

Untuk semua sampel situs asal tumor digunakan untuk menganalisis frekuensi distribusi mutasi di antara berbagai jenis tumor. Seperti yang diharapkan, TP53 ditemukan sebagai gen yang paling sering bermutasi pada kumpulan tumor yang tidak dipilih ini (Gambar 7A). Dataset berisi bias sampel terhadap kanker kolorektal, karsinoma paru-paru non-sel kecil (NSCLC) dan melanoma mungkin disebabkan oleh fakta bahwa pada jenis tumor ini data mutasi sudah mempengaruhi pilihan terapi, dan oleh karena itu dokter lebih cenderung meminta analisis NGS pada pasien dengan tumor tersebut (S7 Gambar).

A) Heatmap jumlah varian per kelompok tumor. Pada sumbu y situs tumor primer yang berbeda digambarkan dan pada sumbu x semua gen dengan data mutasi digambarkan. Jumlah relatif mutasi didefinisikan sebagai jumlah mutasi yang dinormalisasi per jumlah sampel dalam kelompok tumor. B) co-terjadinya varian yang berbeda pada tumor kolorektal. Ukuran lingkaran di sekitar gen menunjukkan berapa kali varian diidentifikasi dalam gen. Garis mewakili kejadian bersama antara gen di mana ketebalan garis menunjukkan jumlah kejadian bersama. Warna lingkaran menunjukkan fungsi gen: gen penekan tumor hijau dan onkogen, tirosin kinase reseptor ungu, jalur pink-PI3K, jalur kuning-KRAS/BRAF.


Kesimpulan

Kemajuan teknologi memungkinkan untuk meningkatkan keterampilan teknis dalam pengurutan asam nukleat. Dari hasil awal teknik Sanger hingga pengurutan generasi berikutnya yang sebenarnya, banyak pekerjaan telah dilakukan untuk mencoba mempertimbangkan "variabilitas individu" untuk beralih ke "obat yang dipersonalisasi". Saat ini, teknologi NGS menonjol sebagai salah satu pendekatan paling kuat dan efektif untuk pengurutan DNA/RNA yang cepat. Dalam penelitian kanker, banyak ilmuwan berusaha untuk memanfaatkan teknologi ini sebaik mungkin dan beberapa laboratorium mulai menunjukkan data yang menarik, terutama dalam kasus CRC. Namun, perlu dicatat bahwa jumlah data di lapangan masih terbatas. Studi tambahan diperlukan untuk mendapatkan keandalan yang lebih signifikan dari teknologi ini untuk aplikasi klinis. Ini berarti bahwa, mungkin, pengoptimalan yang tepat untuk menemukan seluruh potensi platform ini dapat dicapai dalam beberapa tahun dari sekarang. Konsep penggunaan NGS dalam rutinitas klinis menantang, karena alat ini menghasilkan hasil yang baik dalam hal mendeteksi mutasi yang relevan secara klinis, tetapi seringkali tidak dapat mengulangi kinerja yang berhasil ini ketika wilayah genom yang lebih luas menjadi sasaran analisis. Perbaikan khusus dalam metode kontrol kualitas (yaitu identifikasi parameter kualitas yang benar) dapat sangat membantu mengatasi masalah ini. Selain itu, pengenalan teknologi NGS sebagai alat klinis akan membutuhkan langkah-langkah pasti untuk standarisasi proses, penanganan data, dan interpretasi. Perhatian yang lebih besar harus diberikan pada pekerjaan ahli bioinformatika dan ahli biostatistik untuk analisis sejumlah besar data yang akan dihasilkan oleh sistem ini. Tantangan klinis pada prinsipnya didasarkan pada perolehan data yang akurat yang juga dapat dengan mudah diinterpretasikan, dengan mempertimbangkan isu-isu kritis terkait dengan deteksi mutasi somatik pada CRC dan tumor padat, terutama akurasi dalam mengidentifikasi lesi dengan frekuensi alelik yang sangat rendah. Sehubungan dengan hal ini, pendekatan inovatif untuk penyelarasan, assembler, dan pemanggilan varian harus dirancang untuk meningkatkan akurasi seluruh alur kerja NGS. Masih hari ini, pendekatan bioinformatika agnostik tentang penyakit yang sedang dipelajari dan tidak menanamkan dalam perhitungan mereka pengetahuan khusus untuk penyakit atau gen yang sedang dianalisis, seperti yang dilakukan para ilmuwan dalam evaluasi mereka. Dalam arah ini, pendekatan yang mengganggu adalah merancang metode bioinformatika baru yang menyadari patologi dan penyakit yang dicari para ilmuwan dan menambahkan pengetahuan ini saat menjalankan analisis mereka. Menurut pendapat kami, ini akan sangat meningkatkan akurasi hasil NGS. Pada tingkat yang sama, investasi harus dilakukan untuk pendidikan yang tepat dan pembentukan dokter tentang interpretasi signifikansi klinis dari data yang diperoleh.

Kesimpulannya, teknologi NGS jelas merupakan langkah besar ke depan menuju pengobatan yang dipersonalisasi terhadap CRC, tetapi analisis lebih lanjut diperlukan untuk mencapai hasil yang lebih lengkap dan tingkat yang lebih tinggi dalam pandangan kami tentang gambaran besar.


Tonton videonya: Քաղցկեղի, ցավի, հիվանդության և տանջանքի միջով (Agustus 2022).