Informasi

Apa perbedaan antara perilaku protein dan DNA selama elektroforesis gel agarosa?

Apa perbedaan antara perilaku protein dan DNA selama elektroforesis gel agarosa?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Saya merencanakan proyek sains tentang elektroforesis gel, dan saya ingin tahu apakah ada terukur, terukur (misalnya, hal-hal yang dapat saya gambarkan dalam grafik atau bagan) perbedaan antara perilaku protein dan DNA selama elektroforesis gel agarosa. Masukan terperinci dan tautan bermanfaat sangat kami hargai.


Ada dua sifat penting yang menentukan bagaimana molekul akan bergerak selama elektroforesis gel:

  • ukuran dan bentuk molekul
  • muatan molekul

Anda menerapkan medan listrik, dan semua molekul akan bergerak sesuai dengan muatannya. Gel itu sendiri menghambat pergerakan molekul yang lebih besar. Ini berarti bahwa molekul kecil akan bergerak lebih jauh daripada molekul besar.

Asam nukleat seperti RNA dan DNA memiliki muatan negatif yang seragam dari tulang punggung fosfat. Ini berarti bahwa mereka umumnya akan terpisah menurut ukuran dan bentuknya (plasmid dapat hadir dalam berbagai bentuk seperti superkoil, melingkar atau linier).

Protein memiliki muatan yang berbeda, beberapa memiliki muatan positif pada pH yang biasanya digunakan untuk elektroforesis gel, beberapa memiliki muatan negatif, dan beberapa tidak memiliki muatan pada pH tersebut. Jadi jika Anda hanya menjalankan protein pada gel, beberapa akan bergerak mundur, beberapa maju dan beberapa tidak sama sekali.

Untuk memisahkan protein menurut ukurannya, kami menggunakan deterjen SDS untuk mengubah sifat protein, dan memberi mereka muatan yang seragam (SDS bermuatan negatif). Protein juga dijalankan pada gel poliakrilamida dan bukan agarosa karena ukuran pori-pori dalam agarosa tidak cocok untuk ukuran protein yang khas.

Meskipun saya belum pernah melihat orang menggunakan agarosa untuk protein, tampaknya itu mungkin dan terkadang digunakan untuk protein yang lebih besar. Saya menemukan satu makalah yang menjelaskan sebuah protokol, mereka menggunakan konsentrasi agarosa yang sangat tinggi di kisaran 4-5%. Saya menduga mereka tidak akan menangani dengan baik, tetapi Anda harus mencobanya sendiri. Jika protein yang Anda periksa sedikit lebih besar, penggunaan agarosa seharusnya memungkinkan.


Perbedaan Antara SDS PAGE dan Elektroforesis Gel

Elektroforesis dapat digunakan untuk memastikan massa suatu benda biasanya untuk protein dan asam deoksiribonukleat (DNA). Untaian DNA, ketika diperkenalkan ke bahan kimia, dapat mempercepat atau memperlambat proses informasi. Penanda DNA dengan massa yang diketahui digunakan untuk memperkirakan ukuran objek yang bergerak setelah elektroforesis berakhir. Elektroforesis kemungkinan besar menjadi alat yang paling banyak digunakan untuk ahli biologi molekuler dan ahli biokimia.

Ada dua jenis elektroforesis yang umum digunakan dalam proses ini. Ini adalah elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE) dan elektroforesis gel asli.

SDS-PAGE adalah metode elektroforesis gel non-selektif yang digunakan di bidang-bidang seperti: biokimia, forensik, biologi, dan genetika untuk melepaskan protein dari mobilitas elektroforesisnya. SDS adalah surfaktan anionik yang dapat digunakan untuk membantu melisiskan sel selama ekstraksi DNA dan untuk memisahkan protein dalam SDS-PAGE. Selama elektroforesis, campuran protein pertama dicairkan dalam larutan SDS. Kemudian zat yang disebut Mercaptoeethanol diterapkan untuk menghilangkan ikatan disulfida untuk membuat protein linier. Elektroforesis kemudian dimulai. Hasilnya akan menghasilkan dua residu molekul, salah satunya adalah SDS-PAGE.

Tidak adanya SDS-PAGE tidak menjadi masalah karena elektroforesis gel masih dapat dilakukan hanya saja protein tidak kehilangan semua struktur sekunder dan tersiernya dan tidak membuka menjadi batang yang umumnya lurus.

Sedangkan elektroforesis gel native menggunakan gel sebagai media antikonveksi. Biasanya digunakan untuk pemisahan makromolekul biologis seperti DNA, asam ribonukleat (RNA) dan protein. Hal ini juga dapat digunakan untuk pemisahan nanopartikel.

Ada dua gel utama yang digunakan dalam elektroforesis gel asli, yaitu:

Gel agarosa yang digunakan untuk molekul yang lebih besar. Gel ini tidak mengidentifikasi perbedaan kecil antara dua pita molekul. Ini juga hanya digunakan untuk pemisahan DNA. Visualisasi gel agarosa dilakukan dengan campuran etidium bromida.

Gel poliakrilamida yang digunakan untuk molekul yang lebih kecil. Gel ini mengidentifikasi perbedaan antara pita molekul. Selain DNA, juga dapat memisahkan protein.

1.SDS-PAGE adalah metode elektroforesis gel non-selektif yang digunakan di bidang-bidang seperti: biokimia, forensik, biologi, dan genetika untuk melepaskan protein dari mobilitas elektroforesisnya sedangkan elektroforesis gel biasanya digunakan untuk pemisahan makromolekul biologis seperti DNA, asam ribonukleat (RNA), dan protein. Hal ini juga dapat digunakan untuk pemisahan nanopartikel.

2. Elektroforesis gel asli memiliki dua jenis, yaitu: gel agarosa dan gel poliakrilamida.


Elektroforesis gel agarosa untuk pemisahan fragmen DNA

Elektroforesis gel agarosa adalah cara paling efektif untuk memisahkan fragmen DNA dengan berbagai ukuran mulai dari 100 bp hingga 25 kb(1). Agarosa diisolasi dari genus rumput laut Gelidium dan Gracilaria, dan terdiri dari subunit agarobiosa (L- dan D-galaktosa) yang berulang (2). Selama gelasi, polimer agarosa berasosiasi secara non-kovalen dan membentuk jaringan bundel yang ukuran porinya menentukan sifat penyaringan molekul gel. Penggunaan elektroforesis gel agarosa merevolusi pemisahan DNA. Sebelum adopsi gel agarosa, DNA terutama dipisahkan menggunakan sentrifugasi gradien kepadatan sukrosa, yang hanya memberikan perkiraan ukuran. Untuk memisahkan DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa, DNA dimasukkan ke dalam sumur pracetak di dalam gel dan arus diterapkan. Tulang punggung fosfat dari molekul DNA (dan RNA) bermuatan negatif, oleh karena itu ketika ditempatkan dalam medan listrik, fragmen DNA akan bermigrasi ke anoda yang bermuatan positif. Karena DNA memiliki rasio massa/muatan yang seragam, molekul DNA dipisahkan berdasarkan ukuran di dalam gel agarosa dalam pola sedemikian rupa sehingga jarak yang ditempuh berbanding terbalik dengan log dari berat molekulnya (3). Model terkemuka untuk pergerakan DNA melalui gel agarosa adalah "reptasi bias", di mana ujung depan bergerak maju dan menarik sisa molekul sepanjang (4). Laju migrasi molekul DNA melalui gel ditentukan oleh: 1) ukuran molekul DNA 2) konsentrasi agarosa 3) konformasi DNA(5) 4) tegangan yang diberikan, 5) adanya etidium bromida, 6) jenis agarosa dan 7) buffer elektroforesis. Setelah pemisahan, molekul DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar uv setelah pewarnaan dengan pewarna yang sesuai. Dengan mengikuti protokol ini, siswa diharapkan dapat: Memahami mekanisme pemisahan fragmen DNA dalam matriks gel Memahami bagaimana konformasi molekul DNA akan menentukan mobilitasnya melalui matriks gel Mengidentifikasi larutan agarosa dengan konsentrasi yang sesuai untuk kebutuhan mereka Mempersiapkan gel agarosa untuk elektroforesis sampel DNA Menyiapkan aparatus elektroforesis gel dan catu daya Pilih voltase yang sesuai untuk pemisahan fragmen DNA Memahami mekanisme yang memungkinkan etidium bromida untuk visualisasi pita DNA Menentukan ukuran fragmen DNA yang terpisah.


Bagaimana DNA Plasmid Melingkar Berjalan Selama Elektroforesis Gel?

Kondisi elektroforesis gel (termasuk adanya etidium bromida, konsentrasi gel, kuat medan listrik, suhu, dan kekuatan ion dari buffer elektroforesis) dapat mempengaruhi mobilitas DNA plasmid. Karena sifat gel agarosa yang seperti jaring, DNA plasmid sirkular lebih mudah ditangkap di jaring agarosa.

Perangkap elektroforesis adalah keseimbangan antara gaya elektroforesis (menarik DNA plasmid melingkar melawan perangkap) dan difusi (memungkinkan DNA plasmid melingkar lolos dari perangkap). Jadi, molekul melingkar besar memiliki peluang lebih besar untuk terjebak daripada DNA yang lebih kecil. DNA superkoil lebih sulit untuk dijebak karena ukuran DNA bengkok yang kecil.


HASIL DAN DISKUSI

Identifikasi dan Karakterisasi Pewarna yang Cocok

Pada Gambar 1, jalur N1–N7 mewakili pewarna bermuatan negatif (anionik) yang bermigrasi menuju anoda (elektroda positif) selama elektroforesis. Jalur P1–P7 mewakili pewarna bermuatan positif (kationik) yang bermigrasi menuju katoda (elektroda negatif) selama elektroforesis. Karena pewarna bermuatan positif bermigrasi ke arah yang berlawanan dengan elektroforesis gel DNA standar, gel yang mengandung pewarna ini ditempatkan dalam tangki sedemikian rupa sehingga sumur lebih dekat ke anoda daripada katoda, sehingga pewarna dapat bermigrasi melalui gel menuju katoda.

Migrasi pewarna dalam elektroforesis gel. Gel agarosa (1%), buffer 1X TBE, elektroforesis pada 100 V selama 45 menit. Lihat Tabel I untuk identitas pewarna. Jalur N1–N7 bermigrasi menuju anoda dan jalur P1–P7 bermigrasi menuju katoda. Gel diorientasikan untuk migrasi pewarna ke arah yang sesuai. Batang mewakili jarak yang dimigrasikan oleh fragmen DNA dengan ukuran yang ditunjukkan dalam pasangan basa (bp).

Jarak rata-rata yang dimigrasikan oleh setiap pita pewarna ditabulasikan pada Tabel I. Batang mewakili jarak migrasi fragmen DNA, dari 250 pasangan basa (bp) hingga 10.000 bp, dari tangga DNA 1 kb (Promega) dalam kondisi yang identik.

Kurva standar jarak migrasi terhadap log10 ukuran bp dari fragmen DNA dibangun dan digunakan untuk memperkirakan "ukuran" yang setara dari setiap pewarna berdasarkan jarak yang dimigrasikan oleh pewarna. Perhatikan bahwa jarak migrasi diukur di tepi depan pewarna, dan migrasi pewarna dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti konsentrasi gel, jenis gel, dan jenis dan pH buffer [ 1 , 4 , 5 ] (lihat Gambar. 2). Oleh karena itu, "ukuran" ekivalen dari masing-masing pewarna relatif terhadap fragmen DNA linier yang tercantum dalam Tabel I adalah nominal, tetapi dapat digunakan dalam eksperimen pengajaran seperti yang dibahas nanti.

Jarak bermigrasi oleh pewarna dalam gel agar-agar dan larutan elektrolit.

Perhatikan bahwa pewarna bermuatan positif bermigrasi ke arah yang berlawanan dengan DNA dalam medan listrik. Perhatian yang sesuai harus diberikan untuk mengatasi kebingungan siswa atau kesalahpahaman jika ada kebutuhan untuk menggunakan pewarna bermuatan positif untuk mensimulasikan sampel DNA dalam elektroforesis gel. Di sisi lain, pewarna bermuatan negatif bermigrasi dengan bersih dan dapat direproduksi, sehingga pengganti yang ideal untuk sampel DNA.

Beberapa pewarna lain, carmine, phenol red, bromocresol green, dan neutral red telah diuji dan ditemukan tidak bermigrasi selama elektroforesis pada pH 8,0.

Identifikasi dan Karakterisasi Elektrolit yang Sesuai

Garam laboratorium umum dilarutkan hingga 10 m M akhir dalam air (lihat Tabel II). pH dan konduktivitas diukur. Arus yang mengalir selama elektroforesis direkam dari pembacaan arus catu daya Bio-Rad. Semua peralatan berada pada suhu (ambien) awal 22 °C. Kenaikan suhu elektrolit dalam tangki pada akhir run dicatat.

Elektrolit Rumus konsentrasi pH Konduktivitas spesifik (μs cm 1) Elektroforesis pada 60 V selama 60 menit
Rentang saat ini (mA) suhu meningkat (°C)
Tris–borat–EDTA TBE 8.0 620 17–19 2.0
Natrium asetat CH3COONa 10 m M 7.5 702 19–22 2.4
Natrium bikarbonat NaHCO3 10 m M 8.2 767 21–22 2.5
Dinatrium hidrogen fosfat tidak2HPO4 10 m M 8.7 1590 39–59 5.2
Dipotassium hidrogen fosfat K2HPO4 10 m M 8.8 2017 49–66 6.7
Potasium hidroksida KOH 10 m M 11.6 1860 24–30 3.7

Natrium bikarbonat (10 m M ) adalah elektrolit yang tersedia dan mudah disiapkan yang sangat cocok dengan buffer 1X TBE untuk pH dan konduktivitas, menjadikannya alternatif yang nyaman untuk elektroforesis gel pewarna. Natrium asetat (10 m M ) juga merupakan pengganti yang sesuai. Buffer fosfat memiliki konduktivitas yang lebih tinggi, yang memungkinkan arus yang lebih tinggi mengalir melalui tangki, dan ini kadang-kadang mengakibatkan pemanasan lokal yang melunakkan bagian gel agar-agar. Menggunakan K2HPO4 dan Na2HPO4 pada konsentrasi antara 1 dan 5 m M meminimalkan masalah ini.

Elektroforesis menggunakan elektrolit dengan konduktivitas lebih rendah dari 1× TBE mengurangi aliran arus dan memperlambat migrasi zat warna. Dimungkinkan untuk menggunakan elektrolit konduktivitas rendah pada tegangan tinggi untuk mempercepat elektroforesis [ 13 , 14 ]. Ini dapat berguna jika waktu mengajar terbatas, tetapi ini tidak diselidiki karena penggunaan tegangan yang lebih tinggi akan memerlukan peralatan khusus, meningkatkan bahaya listrik, dan dengan demikian tidak cocok untuk kelas.

Elektrolit lain juga diuji tetapi ternyata tidak cocok. Kalium iodida dan natrium tiosulfat menghasilkan endapan, sedangkan natrium klorida, yang disarankan dalam beberapa protokol [6, 8], memiliki konduktivitas tinggi dan menimbulkan bau klorin yang tidak menyenangkan selama elektroforesis.

Identifikasi dan Karakterisasi Kombinasi Pewarna-Elektrolit yang Sesuai

Telah dicatat bahwa beberapa pewarna akan berubah warna atau intensitasnya bila dicampur dengan elektrolit tertentu. Interaksi ini diukur secara sistematis dengan mencampurkan larutan pewarna dengan larutan elektrolit dan menentukan perubahan absorbansinya (lihat Tabel III). Sekitar 50 l setiap pewarna (serial diencerkan hingga 0,0125%) dicampur dengan 150 l elektrolit dalam pelat mikrotiter 96-sumur. Perbedaan absorbansi (perbedaan densitas optik, dOD1) dibandingkan dengan sampel kontrol dari 50 l pewarna dalam 150 l air dicatat. Pembacaan absorbansi untuk masing-masing zat warna dilakukan pada panjang gelombang serapan puncak pada sampel kontrol, ditentukan dari spektrum serapan sampel kontrol. Semua pembacaan dilakukan dalam spektrofotometer pelat mikro Bio-Rad Benchmark Plus.

Pewarna Panjang gelombang serapan puncak (nm) Perubahan absorbansi ketika pewarna dicampur dengan elektrolit
CH3COONa NaHCO3 tidak2HPO4 K2HPO4 KOH
Xilena sianol FF 520 −0.084 −0.079 +0.009 −0.047 −0.583
metil merah 460 +0.199 +0.020 +0.036 +0.047 +0.047
metil oranye 464 −0.128 −0.068 −0.167 −0.176 −0.016
merah kresol 435 −0.237 −0.692 −0.039 −0.603 −0.739
Bromofenol biru 589 +0.224 +0.262 −0.005 −0.253 +0.151
Oranye G 475 −0.128 −0.005 +0.026 −0.042 −0.075
Ponceau S 615 −0.006 +0.004 −0.003 −0.013 −0.384
Janus hijau 600 −0.220 −0.151 −0.081 −0.222 −0.394
hijau cemerlang 625 1.566 1.692 −0.019 1.687 D.C.
metil violet 581 −0.021 +0.182 −0.052 −0.136 1.580
Safranin O 512 −0.072 −0.080 −0.080 −0.009 −0.171
Kristal ungu 589 −0.151 3.178 −0.051 1.585 D.C.
Pironin Y(G) 547 −0.177 1.769 −0.094 −0.266 2.193
Metil hijau 632 −0.022 −0.170 −0.071 −0.120 D.C.
  • “D.C.” menunjukkan kombinasi benar-benar hilang warna. Nilai dOD yang negatif menunjukkan penurunan absorbansi zat warna yang dilarutkan dalam elektrolit dibandingkan dengan zat warna dalam air saja dan dengan demikian menunjukkan adanya pergeseran warna atau penurunan intensitas warna. Sebaliknya, nilai dOD positif dapat menunjukkan peningkatan intensitas warna. Angka yang dicetak miring menunjukkan penurunan lebih dari 1,0 unit OD.

Secara umum, pewarna bermuatan negatif tetap stabil dalam elektrolit pengganti, tetapi beberapa pewarna bermuatan positif menunjukkan penurunan absorbansi yang signifikan, sesuai dengan hilangnya intensitas warna. Panel penuh tujuh pewarna bermuatan positif hanya mempertahankan warnanya di Na2HPO4.

Semua pewarna stabil ketika digunakan dalam buffer 1X TBE (lihat Gambar 1).

Identifikasi dan Karakterisasi Kombinasi Elektrolit yang Sesuai

Gel slab yang digunakan dalam elektroforesis harus memiliki sifat fisik yang sesuai dengan formulasi gel agarosa. Gel dibuat dengan mensuspensikan serbuk agar dalam larutan elektrolit 10 m M sampai konsentrasi akhir 1% (b/v) dan dididihkan dalam oven microwave. Setelah periode pendinginan yang singkat, gel cair dituangkan ke dalam baki pengecoran minigel dengan sisir dimasukkan. Setelah pengaturan, gel dijalankan pada 60 V selama 60 menit dalam elektrolit masing-masing untuk memeriksa retensi bentuk dan konsistensi.

Hanya larutan elektrolit dengan pH basa yang cocok, karena menggunakan larutan dengan pH asam tampaknya mengganggu pengaturan gel agar-agar, menghasilkan gel yang sangat lunak dan lengket (data tidak ditampilkan). Tabel IV menunjukkan sifat-sifat kombinasi gel-elektrolit yang diuji. Secara umum, ditemukan bahwa kalium hidroksida tidak cocok untuk digunakan dalam elektroforesis gel karena gel yang dibuat dengan elektrolit ini cenderung memiliki gips warna dan tekstur lembut, lengket yang tidak mempertahankan bentuk sumur.

Elektrolit Agar–agar (merek Swallow Globe) Agar–agar (merek Rose) Konnyaku jelly (merek Red Man) Konnyaku jelly (merek Jim Willie) Agar bakteriologis (Oxoid)
CH3COONa R R
NaHCO3 M M
tidak2HPO4 R R
K2HPO4 M M
KOH C C, A C, A C, A C
  • = cocok untuk elektroforesis A = gel bersifat perekat C = gel berwarna dan/atau tampak keruh M = gel meleleh selama elektroforesis R = gel mengeras terlalu cepat.

Gel berbasis Konnyaku juga tidak cocok, karena dibuat dengan Na2HPO4 dan CH3COONa akan diatur terlalu cepat untuk menghasilkan slab gel dengan benar, sedangkan yang dibuat dengan K2HPO4 dan NaHCO3 cenderung meleleh selama elektroforesis. Diamati bahwa selama elektroforesis, aliran arus dan konduktansi melalui tangki yang mengandung gel berbasis konnyaku lebih tinggi daripada gel yang terbuat dari agar atau agarosa, mungkin karena campuran bubuk konnyaku komersial mengandung senyawa yang larut ke dalam elektrolit di dalam tangki, sehingga meningkatkan konduktivitas.

Elektroforesis Pewarna dalam Kombinasi Gel-Elektrolit Terpilih

Panel pewarna dipilih untuk digunakan dalam elektroforesis, berdasarkan stabilitasnya dalam elektrolit yang akan digunakan dalam tangki elektroforesis. Ini adalah xylene cyanol FF, methyl orange, cresol red, bromophenol blue, orange G, dan ponceau S. Migrasi masing-masing pewarna dicatat setelah elektroforesis pada 60 V selama 60 menit dalam minigel. Pewarna dijalankan secara individual dan sebagai campuran dari keenam pewarna bersama-sama pada kombinasi gel-elektrolit yang diidentifikasi sesuai dalam Tabel IV. Campuran pewarna memisahkan dengan bersih selama elektroforesis dalam gel agarosa-TBE, dan tampaknya tidak bereaksi atau berinteraksi satu sama lain selama elektroforesis (data tidak ditampilkan).

Gambar. 2 menunjukkan jarak yang dipindahkan oleh panel enam pewarna bermuatan negatif dalam gel yang dibuat dari agar-agar 1% (merek Swallow Globe) dalam elektrolit yang dipilih. Jarak migrasi zat warna sedikit berbeda pada masing-masing elektrolit dan tampak berbeda dengan pH. Gel yang dibuat dari agar–agar merek Rose dan agar bakteriologis menunjukkan hasil yang serupa (data tidak ditampilkan). Secara umum, semakin tinggi pH elektrolit, semakin jauh pewarna bermigrasi. Dalam keempat elektrolit yang digunakan, merah kresol bermigrasi dengan bromofenol biru, sedangkan dalam buffer TBE merah kresol akan bermigrasi lebih sedikit daripada bromofenol biru (lihat Gambar 1 dan Tabel I). Ini tampaknya tidak bergantung pada pH karena pH TBE adalah 8,0, nilai antara CH3COONa dan NaHCO3.

Simulasi Elektroforesis Gel DNA

Elektroforesis gel sampel DNA biasanya dilakukan dalam gel agarosa “kapal selam” horizontal yang direndam dalam buffer konduktif. Ketika arus dilewatkan melalui larutan buffer dalam tangki elektroforesis, medan listrik dihasilkan. Gugus fosfat dalam DNA bermuatan negatif, memberikan molekul DNA muatan negatif secara keseluruhan. Dalam medan listrik, DNA bergerak menuju elektroda bermuatan positif (anoda) dari ruang elektroforesis [1].

Fragmen DNA dipisahkan berdasarkan ukuran karena fragmen yang lebih kecil bermigrasi lebih jauh melalui pori-pori matriks gel daripada fragmen yang lebih besar. Jarak yang dimigrasikan berbanding terbalik dengan log10 dari berat molekul fragmen DNA. Kecepatan migrasi ditentukan oleh kekuatan medan yang diterapkan di seluruh gel. Kuat medan listrik berbanding lurus dengan beda potensial (tegangan yang diberikan) dan berbanding terbalik dengan panjang medan listrik [ 4 , 5 ]. Meningkatkan tegangan atau mengurangi jarak antara elektroda dapat meningkatkan kekuatan medan, sehingga meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA. Namun, semakin tinggi tegangan yang diberikan, semakin besar arus yang mengalir melalui tangki elektroforesis, menghasilkan panas yang dapat melelehkan gel [ 4 , 5 ].

Setelah elektroforesis, gel agarosa kemudian diwarnai dengan etidium bromida. Etidium bromida mengikat molekul DNA dan berfluoresensi di bawah sinar UV, mengungkapkan posisi "pita" DNA [ 1 , 2 ]. Sebuah “tangga DNA” (penanda) yang terdiri dari fragmen DNA dengan ukuran yang diketahui dapat dijalankan bersama sampel DNA pada gel. Ukuran fragmen sampel yang tidak diketahui dapat ditentukan dengan membandingkan jarak migrasinya dengan jarak fragmen DNA di tangga [ 1 , 4 , 5 ].

Materi pengganti yang disajikan di sini dapat digunakan secara keseluruhan atau sebagian untuk mensimulasikan elektroforesis gel DNA untuk digunakan dalam aplikasi pengajaran. Namun, poin-poin tertentu harus diingat untuk mengelola pemahaman konseptual siswa tentang proses yang terlibat. Perhatian harus diberikan untuk memastikan bahwa sifat warna-warni dari pengganti pewarna tidak membingungkan siswa dan mengakibatkan miskonsepsi. Penting, misalnya, untuk menekankan bahwa warna tidak menentukan "ukuran" fragmen DNA yang disimulasikan, dan bahwa penggunaan pewarna di sini berbeda dengan pewarnaan DNA untuk tujuan visualisasi.

Poin penting lainnya adalah bahwa berat molekul pewarna tidak hanya menentukan jarak migrasi dalam gel. Tidak seperti DNA, senyawa pewarna mungkin memiliki kerapatan muatan yang berbeda relatif satu sama lain. Oleh karena itu, berat molekul zat warna tidak memiliki hubungan langsung dengan “ukuran” nyata dari pita DNA simulasi yang dibentuk oleh zat warna.

Untuk aplikasi di mana elektroforesis gel berbasis pewarna dimaksudkan untuk mensimulasikan elektroforesis gel DNA untuk tujuan menentukan ukuran molekul "fragmen DNA yang tidak diketahui" dengan membangun kurva standar jarak yang dimigrasikan terhadap berat molekul "fragmen DNA yang diketahui", “ukuran” nominal setiap pita diberikan dalam Tabel I. “Ukuran” yang tampak dari setiap pewarna diperkirakan dari kurva standar yang dihasilkan dari jarak yang dimigrasikan oleh fragmen DNA dari tangga DNA standar.

Nilai-nilai ini dapat digunakan bersama dengan jarak terukur yang dimigrasikan oleh masing-masing pewarna dalam eksperimen siswa untuk membuat kurva standar yang dapat digunakan untuk memperkirakan, misalnya, "ukuran" pewarna yang tidak ada dalam campuran tangga. Perhatikan bahwa nilainya cukup akurat untuk konsentrasi gel (1,0 ± 0,2%).

Elektroforesis Gel Improvisasi

Jika tersedia peralatan elektroforesis komersial, sediakan gel run yang paling konsisten dan paling aman. Jika tidak, berimprovisasi dengan bahan yang tersedia relatif sederhana dan protokol tersedia [8, 9]. Casting gel dalam wadah penyimpanan makanan polypropylene kecil, yang kemudian digunakan di tempat untuk elektroforesis [ 8 ], sangat efektif.

Salah satu perbaikan yang berguna untuk desain yang dijelaskan adalah untuk melemparkan gel dengan "sisir" untuk menghasilkan sumur untuk menampung sampel pewarna yang akan dimuat alih-alih menggunakan strip kertas saring yang direndam pewarna yang dimasukkan langsung ke dalam gel. Sisir dapat diambil dari set elektroforesis yang ada atau dapat dibuat dengan memotong slot menjadi selembar lembaran plastik setebal 1-1,5 mm. Meskipun ini membutuhkan lebih banyak upaya untuk memposisikan dan menopang sisir selama pengecoran, pita pewarna tampak lebih jelas dengan lebih sedikit noda saat dimuat di dalam sumur.

Kami juga merekomendasikan untuk meningkatkan pengaturan dengan menggunakan batang karbon berdiameter 4-5 mm untuk elektroda. Elektroda platinum atau baja tahan karat lebih disukai karena ketahanannya terhadap korosi, tetapi ini adalah barang yang mahal dan khusus. Kawat tembaga telanjang sering digunakan [ 8 , 9 ], tetapi ini memiliki kelemahan dalam menghasilkan endapan berwarna dan menjadi terkorosi dalam prosesnya. Batang karbon memiliki ketahanan yang lebih tinggi, tetapi tidak menimbulkan korosi dan dapat digunakan kembali.

Sebuah kawat tembaga dengan klip buaya dijepit ke ujung setiap batang karbon. Klip buaya dan ujung batang karbon dibungkus rapat dengan film penyegel laboratorium (“parafilm”) untuk mencegah logam klip bersentuhan dengan larutan elektrolit. Setelah penuangan gel dalam wadah makanan (∼15 cm kali 10 cm, atau 6" kali 4"), gel dipotong sejajar dengan sisi panjang wadah sekitar 2 cm dari dinding dan strip gel di kedua sisi wadah. ujungnya diangkat. Tempatkan satu batang karbon ke masing-masing dari dua palung yang dibuat, sedemikian rupa sehingga sejajar satu sama lain tetapi dengan kabel listrik terpasang di ujung yang berlawanan. Diatur dengan cara ini, medan listrik yang cukup seragam melewati bagian tengah gel, memungkinkan pemisahan elektroforesis yang efektif dari pewarna pada 12 V dalam waktu 60 menit (lihat Gambar 3).

Peralatan buatan sendiri untuk elektroforesis gel improvisasi. 1% agar-agar gel, 10 m M larutan elektrolit natrium bikarbonat. Sekitar 7,5 l setiap larutan pewarna dimuat per sumur dan 12 V diterapkan selama 60 menit. Semua pewarna dibuat dalam larutan gliserol 20%. jalur (kiri ke kanan): 0.1% xylene cyanol FF, 0.1% bromophenol blue, 0.2% orange G, 0.1% ponceau S. Empat jalur berikutnya ulangi. Kekuatan medan di ruang buatan ini adalah 2 V cm 1 .

Untuk keamanan dan untuk meminimalkan pembentukan panas di dalam wadah kecil, hanya tegangan rendah (<24 V) yang harus digunakan. Trafo DC 12 V tujuan umum (200–500 mA) sudah tersedia dan cocok untuk penggunaan ini. Aliran arus ditemukan dalam kisaran 12-20 mA. Jika tegangan yang lebih tinggi antara 12 dan 24 V diinginkan untuk mempercepat proses dan catu daya laboratorium yang sesuai tidak tersedia, maka catu daya untuk notebook komputer dapat digunakan karena banyak di antaranya memiliki keluaran tegangan dalam kisaran ini. Perawatan harus dilakukan dalam semua kasus untuk menghindari korsleting, seperti mencegah elektroda bersentuhan satu sama lain.

Migrasi pewarna dalam kekuatan medan rendah dari tangki improvisasi lambat. Oleh karena itu, pewarna terbaik untuk digunakan adalah pewarna yang bermigrasi paling cepat untuk meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk melihat pita yang terpisah dengan jelas. Ponceau S, orange G, dan bromophenol blue bermigrasi paling cepat, sedangkan xylene cyanol FF berguna sebagai pewarna keempat karena bermigrasi paling lambat. Keempat pewarna bersama-sama menciptakan rangkaian pita warna-warni yang terpisah dengan baik.

Kegiatan Kelas Menggunakan Elektroforesis Gel Berbasis Pewarna

Menentukan Ukuran Fragmen DNA Tidak Diketahui – Salah satu aplikasi elektroforesis gel DNA sehari-hari di laboratorium penelitian adalah analisis fragmen DNA yang dihasilkan oleh eksperimen seperti amplifikasi polymerase chain reaction (PCR) atau ekstraksi DNA plasmid dari bakteri. Penentuan ukuran fragmen DNA adalah teknik dasar dan dapat dengan mudah disimulasikan dengan menyiapkan "tangga pewarna" dan menggunakan satu atau dua pewarna lain sebagai "DNA tidak diketahui."

Pewarna yang dipilih untuk tangga harus dipisahkan dengan baik. Tangga pewarna harus disiapkan dari awal dan tidak dibuat hanya dengan mencampur beberapa pewarna bersama-sama, yang akan mengakibatkan pengenceran masing-masing pewarna. Pewarna yang dipilih untuk tangga harus ditimbang dan kemudian ditempatkan dalam botol yang sama sebelum menambahkan volume yang sama dari larutan gliserol 20% seolah-olah itu hanya satu pewarna.

Sampel “DNA tidak diketahui” idealnya adalah pewarna yang tidak termasuk dalam campuran tangga DNA. Siswa kemudian dapat menjalankan gel dengan campuran tangga dan sampel yang tidak diketahui, membuat grafik kurva standar menggunakan nilai nominal “ukuran bp” yang diberikan pada Tabel I, dan kemudian menggunakan grafik untuk memperkirakan ukuran sampel yang tidak diketahui [1].

sidik jari DNA – Mungkin aplikasi elektroforesis gel berbasis pewarna yang paling sederhana dan mungkin paling umum adalah simulasi “sidik jari DNA forensik.” Hal ini dapat dicapai dengan menyiapkan beberapa variasi campuran pewarna, yang mewakili profil DNA dari beberapa "tersangka", dan menetapkan persiapan duplikat salah satunya sebagai sampel "DNA TKP". Variasi dalam hal ini adalah membebaskan tersangka menggunakan sampel "DNA TKP" yang unik.

Identifikasi Genotipe – Eksperimen berbasis PCR yang populer digunakan dalam pengajaran di kelas adalah untuk menentukan genotipe setiap siswa di kelas pada lokus tertentu, seperti Alu PV92 [1]. Genotipe divisualisasikan menggunakan elektroforesis gel agarosa untuk keberadaan satu atau kedua pita DNA. Setiap pita mewakili satu dari dua kemungkinan alel untuk gen atau lokus. Latihan ini juga dapat digunakan untuk mengajarkan konsep pewarisan dan genetika populasi. Pewarna berpasangan dengan warna serupa, seperti jingga metil dan jingga G, merah kresol, dan ponceau S, atau pewarna kationik, hijau cemerlang dan hijau metil, dapat digunakan untuk mensimulasikan dua bentuk alelik DNA yang diamplifikasi dalam eksperimen semacam itu dan dengan demikian mencakup banyak poin pengajaran utama, tanpa perlu PCR.

Selain latihan sains DNA standar yang disebutkan sebelumnya, elektroforesis gel berbasis pewarna juga dapat digunakan sebagai sistem untuk memandu pembelajaran berbasis inkuiri, di mana siswa dapat, misalnya, menyelidiki pengaruh konsentrasi gel atau kekuatan medan pada jarak yang dimigrasikan. Orang lain juga menyarankan penggunaan pewarna kationik dan anionik pada gel yang sama (dengan sumur pemuatan terbentuk di tengah gel) untuk menghubungkan diskusi dengan konsep ilmu fisika, seperti efek muatan pada arah migrasi di medan listrik [ 7 ] (lihat Gambar 4).

Contoh zat warna bermuatan. Struktur dua contoh pewarna. Oranye G adalah pewarna anionik atau bermuatan negatif. Pyronine Y (juga dikenal sebagai pyronine G) adalah kationik, pewarna bermuatan positif [ 12 ].


Protokol

Bagian 1: Menjalankan gel Anda

  1. Tambahkan pewarna pemuatan 2,5 & mikrol ke sampel M13KO7 dari terakhir kali. Pewarna yang dimuat mengandung xylene cyanol sebagai pewarna pelacak untuk mengikuti kemajuan elektroforesis (sehingga Anda tidak mengeluarkan fragmen terkecil dari ujung gel Anda!) serta gliserol untuk membantu sampel meresap ke dalam sumur.
  2. Jentik tabung eppendorf untuk mencampur isinya lalu putar cepat di microfuge untuk membawa isi tabung ke bawah.
  3. Muat gel dalam urutan yang ditunjukkan pada tabel di bawah ini. Satu kelompok akan memuat di sumur 1 sampai 3, kelompok lain akan memuat di sumur 5 sampai 7. Untuk memuat sampel Anda, tarik 25 &mikrol ke ujung P200 Anda. Turunkan ujung di bawah permukaan penyangga dan langsung di atas sumur. Anda berisiko melubangi bagian bawah sumur jika Anda menurunkan ujungnya terlalu jauh ke dalam sumur itu sendiri (menusuk sumur = buruk!). Keluarkan sampel Anda ke dalam sumur. Jangan lepaskan plunyer pipet sampai Anda mengeluarkan ujung pipet dari kotak gel (atau Anda akan menarik sampel kembali ke ujungnya!).
  4. Setelah semua sampel dimuat, pasang kotak gel ke catu daya dan jalankan gel pada 125V selama tidak lebih dari 45 menit.
  5. Anda akan diperlihatkan cara memotret gel Anda dan memotong pita DNA yang relevan.
Jalur, sampel, dan volume untuk dimuat.
JALAN SAMPEL VOLUME UNTUK DIMUAT
1 Penanda 1 kb 5 &mikro
2 Sampel yang Belum Dipotong M13KO7 Semua Volume Reaksi (

Memuat gel. (Gambar oleh MIT OpenCourseWare.)

Bagian 2: Mengisolasi/Memurnikan DNA

Untuk memurnikan DNA Anda dari agarosa, Anda akan menggunakan kit yang dijual oleh Qiagen. Reagen memiliki nama yang tidak informatif dan isinya adalah hak milik. Kit Pemurnian Agarose membutuhkan pengikatan DNA ke kolom spin dengan membran silika-gel, membersihkan garam dan mengelusi DNA dari membran.

  1. Tambahkan 550 &mikrol QG ke irisan agarosa Anda.
  2. Inkubasi pada 50°C selama 10 menit sampai agarosa benar-benar larut. Setiap beberapa menit, Anda dapat mengeluarkan tabung dari suhu 50°C untuk mengibaskan isinya. Ini akan membantu melarutkan agarosa.
  3. Tambahkan 125 & mikrol isopropanol ke dalam tabung eppendorf Anda.
  4. Dapatkan QIAquick spin column (ungu) dengan tabung koleksi (bening) dari fakultas pengajaran. Beri label pada kolom spin (bukan tabung pengumpul!) kemudian pipet campuran agarosa terlarut di bagian atas kolom. Microfuge kolom dalam tabung koleksi selama 60 detik. Kapasitas maksimum kolom QIAquick adalah 800 &mikrol! If you have more than 800 µl in your mixture, you will need to repeat this step.
  5. Discard the flow-through in the sink and replace the spin-column in its collection tube. Add 750 µl of PE to the top of the column and spin as before.
  6. Discard the flow-through in the sink and replace the spin-column in the collection tube. Add nothing to the top but spin for 60 seconds more to dry the membrane.
  7. Trim the cap off a new eppendorf tube and label the side with your team color and the date. Place the spin-column in the trimmed eppendorf tube and add 30 µl of EB to the center of the membrane.
  8. Allow the column to sit at room temperature for one minute and then spin as before. The material that collects in the bottom of the eppendorf tube is your purified plasmid backbone, ready to be ligated. Give it to the teaching faculty who will store it with your insert until next time.

Part 3: Titering Phage

One technique you will see several times this term is plating for plaques. The idea of this technique is simple. Since phage infection slows down the growth of bacteria, any phage-infected cell will grow less quickly than an uninfected one, giving rise to a zone that is more clear on a lawn of fully grown cells. This zone is called a plaque and by counting the number of plaques formed, it is possible to measure the number of infective phage in the sample you are testing. The number of infected phages is measured as PFUs, which is "plaque forming units per ml."

Plaques formed by bacteriophage upon infection of susceptible bacteria. Source: Assorted Views of Bacteriophage Plaques. © Quiroz. Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.

  1. Start by placing 6 LB plates in the 37° incubator to prewarm them. If there is any condensation on the surface of the plates, then you can leave the lids slightly ajar to dry the plate surface.
  2. Aliquot 200 µl of bacteria into 6 small, sterile test tubes. The bacteria you are using are the strain ER2267 since this strain has a selectible F'. Label the tops of each tube with a colored sticker and one of the following: none, none, 10 -4 E4, 10 -6 E4, 10 -4 K07, 10 -6 K07.
  3. The teaching faculty have two phage stocks for you to compare, an M13KO7 phage stock and a stock of another M13 phage called E4. You will need to serially dilute each stock, making stepwise 1/100 dilutions in eppendorf tubes. For example, add 10 µl of a phage stock to 990 µl sterile water for a 10 -2 dilution, then repeat, using 10 µl of the 10 -2 dilution into 990 µl sterile water to make a 10 -4 dilution. Vortex the dilutions before removing any liquid and change pipet tips to prepare each new dilution. Continue serially diluting the phage to final concentrations that are 10 -4 th and 10 -6 th as concentrated as the starting stock.
  4. Mix 10 µl of one of the 10 -4 dilutions into a tube with bacteria.
  5. Mix 10 µl of one of the 10 -6 dilution into another tube with bacteria.
  6. Repeat with the dilutions of the other phage stock.
  7. One of the teaching faculty will show you how to mix 3 ml of top agar into one of the uninfected samples you have prepared and how to pour the molten mix onto the surface of a prewarmed LB plate.
  8. You and your partner should add top agar to the other uninfected sample and the four phage infected ones.

Allow the top agar to solidify by leaving the plates on the bench at least 5 minutes then stack them and wrap them with your colored tape and finally move them to the 37° incubator to grow overnight. One of the teaching faculty will remove them from the incubator tomorrow and store them for you until next time.


Principle:

The negatively charged DNA molecules migrate towards the positive charge under the influence of constant current, thus the separation depends on the mass and charge of DNA. The DNA molecules are forced to move through the agarose gel pores. The rate of the migration depends on,

      • The strength of the field
      • The hydrophobicity of the DNA
      • The ionic strength of the buffer
      • The size and shape of the DNA
      • The temperature of the buffer

      Three of the important factors that affect DNA migration rate are,

      As we discussed earlier if the concentration of agarose is lower, the DNA can migrate easily and faster and vice versa.

      The supercoiled DNA migrates faster than the linear DNA and circular DNA.

      The supercoiled form of DNA is more compact than other forms and this is the reason for its speedy migration.

      If the size of a DNA is larger, the migration rate of it is lower and therefore PCR product of several hundred base pairs migrates faster than the total genomic DNA.


      When is gel electrophoresis used to separate DNA fragments?

      Gel electrophoresis can be used for a range of purposes, for example:

      • To get a DNA fingerprint for forensic purposes
      • To get a DNA fingerprint for paternity testing
      • To get a DNA fingerprint so that you can look for evolutionary relationships among organisms
      • To check a PCR reaction.
        See the video clip: Using gel electrophoresis to check a PCR reaction
      • To test for genes associated with a particular disease.
        Find out more in the article, Gel electrophoresis can be used to find genes associated with a disease.

      Now this image is pretty good but what is the problem?

      Here the annealing temperature of the primer is not selected properly. So the primer is compromised with other complementary sequences present in the genome. The annealing temperature is too low in comparison with its actual annealing temperature.

      Due to this reason, more than 4 bands of PCR amplicons are observed in the gel. Further, see the green arrow, a bubble hindered the separation of the DNA ladder.

      Conclusively, the PCR is not performed with the optimum PCR conditions.


      SYBR Green

      The SYBR Green I and II stains (again, marketed by Molecular Probes) are optimized for different purposes. Because they bind to DNA, they are still considered potential mutagens and because of that, they should be handled with care.

      SYBR Green I is more sensitive for use with double-stranded DNA, while SYBR Green II, on the other hand, is best for use with single-stranded DNA or RNA. Like the popular ethidium bromide stain, these highly sensitive stains fluoresce under UV light.

      Both SYBR Green I and II are recommended by the manufacturer to be used with "254 nm epi-illumination Polaroid 667 black and white film and a SYBR Green gel stain photographic filter" to achieve detection of 100 pg of RNA or single-strand DNA per band.


      Successful DNA Plasmid Preps

      Although DNA plasmid preps can return multiple forms of DNA, there is only one kind you want for successful cloning and transfection: supercoiled. Make sure you know how to increase your recovery of good quality supercoiled DNA. Did this help you understand why you get three bands when running plasmid DNA on agarose gels? Do you have any other plasmid prep tips? We’d love to hear in the comments.

      Originally published October 8, 2014. Reviewed and republished April 2021.


      Tonton videonya: Gel Electrophoresis (Agustus 2022).